原始文献：

Zhang, X., Kim, J., & Tonegawa, S. (2020). Amygdala Reward Neurons Form and Store Fear Extinction Memory.Neuron, 105(6).

原文链接：

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0896627319310918www.sciencedirect.com

恐惧消退需要形成新的印迹（engram）细胞。
恐惧消退印迹细胞存在于基底外侧杏仁核的Ppp1r1b+神经元中。
恐惧消退印迹细胞和奖赏相关神经元是高度重叠的，功能上相互转换。
恐惧消退记忆是一种奖赏记忆——期望中有害刺激的缺失是一种奖赏。

恐惧行为是神经科学研究中的一个重要课题。在模式动物上研究恐惧行为的一个常见方法就是利用恐惧条件反射，即同时给予动物无害刺激（条件刺激，CS）和有害刺激（非条件刺激，US），使动物对无害刺激形成条件反射。恐惧记忆形成后，长时间给予动物单纯的条件刺激能够使动物的恐惧条件反射减弱，这被称作恐惧消退（fear extinction）。杏仁核（amygdala）被认为是一个与恐惧密切相关的脑区。之前的研究已经发现，基底外侧杏仁核（basolateral amygdala，BLA）中存在两类神经元，Ppp1r1b+神经元和Rspo2+神经元（根据特定的基因表达区分），它们分别对正价刺激和负价刺激起反应，并且相互间存在拮抗作用。本文的作者就试图研究Ppp1r1b+神经元在恐惧消退中的作用。

研究人员以小鼠为实验对象采用了一个环境依赖的恐惧消退范式。实验组小鼠在第Yi天在实验笼中接受三个周期的电刺激，对环境产生恐惧记忆。第er天小鼠仍被放入实验笼中，但不再有电刺激，以此进行恐惧消退的训练。第三天小鼠再一次被放入无电刺激的实验笼中进行测试。另外有两个对照组实验：无恐惧消退训练的NonExt组和始终无电刺激的NonShock组。实验组和NonExt组在第Yi天实验中，恐惧表现（freezing）逐渐明显；经过第er天的消退训练后，实验组的恐惧程度显著低于NonExt组，而NonShock组的恐惧表现始终处于极低的水平。

研究人员随即对实验组和对照组的小鼠脑组织进行了单分子荧光原位杂交（smFISH）来检测Fos、Rspo2、Ppp1r1b的表达情况。荧光结果显示，Rspo2+神经元的活性在仍具有恐惧记忆的NonExt组小鼠中显著，而在实验组和NonShock组小鼠中没有显著区别；Ppp1r1b+神经元仅在发生了恐惧消退的实验组小鼠中被激活。

接下来研究人员又利用显微内窥镜进行在体钙成像追踪Rspo2+神经元和Ppp1r1b+神经元在恐惧消退实验期间的激活动态。Rspo2+神经元在第Yi天受到电刺激时（恐惧习得）以及第er天刚进入实验笼时（恐惧取回）活性上升，在恐惧消退过程中及第三天的测试中活性降低。Ppp1r1b+神经元则刚好相反，在恐惧消退过程中及恐惧消退后具有高活性。研究者也发现，在恐惧习得中被激活的Rspo2+神经元，大多会在恐惧取回时被再度激活；而在恐惧消退过程中被激活的Ppp1r1b+神经元，也大多会在第三天的恐惧消退测试中被再度激活。钙成像的结果与c-Fos一致，反映了Ppp1r1b+神经元在恐惧消退中被激活，而恐惧激活的Rspo2+神经元在恐惧消退中活性受抑制。

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研究人员分别向Rspo2-Cre小鼠和Ppp1r1b-Cre小鼠中注射携带有ChR2或eArchT的Cre依赖AAV病毒，特异性标记并操纵Rspo2+神经元和Ppp1r1b+神经元。光遗传实验显示，在恐惧消退期间激活Rspo2+神经元或抑制Ppp1r1b+神经元能够显著降低恐惧消退的程度，而激活Ppp1r1b+神经元或抑制Rspo2+神经元可以促进恐惧消退（加速习得过程），但对恐惧消退的Z终结果没有影响。在恐惧消退习得完成后（第三天测试时）抑制Ppp1r1b+神经元可以逆转消退学习的结果，但激活该神经元则无显著影响。光遗传实验的结果进一步表明了这两类神经元在恐惧消退中的拮抗作用，以及Ppp1r1b+神经元在恐惧消退的记忆中的重要作用。

研究人员接下来开始探究能否在pBLA的Ppp1r1b+神经元中找到恐惧消退的印迹（engram）细胞。研究人员向Ppp1r1b-Cre小鼠的pBLA中注射了下图所示的AAV病毒，使他们能够在特定时间标记上激活了的Ppp1r1b+神经元并对其进行遗传操作。已经恐惧消退完成的小鼠在第三天的测试时激活的Ppp1r1b+神经元被标记并转入ChR2。这些小鼠再一次经历了三天的恐惧消退实验，而光激活上述被标记的Ppp1r1b+神经元能够显著提升恐惧消退的速度。对Rspo2+神经元进行同样的实验则没有任何显著结果。利用同样的方法，向被标记的Ppp1r1b+神经元中转入ArchT，光抑制这些Ppp1r1b+神经元可以显著逆转恐惧消退的结果，并且Rspo2+神经元的活性显著提高。这些结果表明，恐惧消退记忆的印迹细胞确实存在于Rspo2+神经元中，这些印迹细胞对恐惧消退记忆的维持其中重要的作用，并且能够抑制与恐惧有关的Rspo2+神经元的活动。

摘自原文Fig4，只有被激活并且表达Ppp1r1b的神经元会被转入ChR2-EYFP／EYFP，并且该序列的表达可以通过给小鼠喂食doxycycline (Dox)进行抑制，因此研究人员可以标记上特定时间的目标神经元。

之前的研究表明，pBLA中的Ppp1r1b+神经元有一部分对饮食奖赏有反应，研究人员接下来研究了这两种Ppp1r1b+神经元间的关系。小鼠被禁水Yi天后再给予饮水奖赏，研究人员用病毒注射标记上了对奖赏起反应的Ppp1r1b+神经元。小鼠接下来被分为四组，分别进行禁水+给水，禁食+给食，恐惧消退，恐惧（无消退，即NonExt组）的实验。研究人员随即检测了c-Fos表达情况，结果显示，饮水奖励、进食奖励和恐惧消退的三组小鼠之间，被标记的Ppp1r1b+神经元中表达c-Fos的比例和表达c-Fos的神经元中被标记的比例都没有显著差异，但都显著高于NonExt组。这一结果显示对奖赏起反应的Ppp1r1b+神经元与恐惧消退相关的Ppp1r1b+神经元有着很高的重叠度。动态的钙成像实验也进一步证明了这一结果。

研究人员还用神经元被标记/遗传操作的小鼠进行了光遗传自我刺激行为测试（optogenetic self-stimulation behavior test）和光遗传实时空间偏好测试（optogenetic real-time place preference test）。无论是通过饮水奖励还是恐惧消退标记上Ppp1r1b+神经元的小鼠，都有相当一部分表现出了自我刺激行为或空间偏好（即有主动激活Ppp1r1b+神经元的偏好）。而光激活通过饮水奖励标记/遗传操作的Ppp1r1b+神经元也能够提高恐惧消退的速度。这些结果进一步表明了与恐惧消退相关的和与饮食奖赏相关的Ppp1r1b+神经元是高度相关的，恐惧消退在神经元水平上可以被认为是一种奖赏。

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