摘要
应激是机体对机体外界或机体内部各种刺激产生的非特异性应答反应的总和。适度应 激可提高机体的反应能力和维持内环境的稳态；过度应激则会对人体产生危害，导致机体 神经***和心理的变化。随着现代社会生活节奏的加快，工作和生活负担的加重，人们 面临的工作压力及心理压力越来越大。越来越多的证据表明，慢性应激是人类多种重大疾 病的重要病因和诱因，能引发多种重大ji病，如肿瘤、心血管ji病、焦虑症、抑郁症、阿 尔茨海默病（Alzheimer抯 disease, AD)等躯体和精神ji病。
军人作为一个特殊群体，面临着复杂而强烈的**应激因素，如生存环境恶劣、精神 高度紧张及**作业任务繁重等。强烈的**应激因素不仅会对军人健康造成直接危害， 还将产生严重的体力、脑力和心理损害，是造成**作业能力降低和非战斗性减员的重要 因素。因此，**应激损伤防护措施的研究是近年来各国**的研究重点。目前对于** 应激主要以心理干预和补充氨基酸和维生素对应激损伤进行防治，但起效时间较慢，效果 有限。
己有研究表明，无论何种原因引起的应激，其病理生理学变化均是神经***免yi调 节（Neuroendocrine-immune network, NIM)网络的平衡失调。现代应激理论认为，NINOS 络是维持机体内环境及生理功能平衡和稳定的基础，该观点与中医学中的“阴阳气血、脏 腑机能”平衡的整体观是高度一致的。因此依据中医整体观、辨证观、平衡观以及现代应 激理论，探讨采用中医药手段干预应激的方法和途径、从中药中寻找或创制防治应激损害 的药wu是一个具苻良好前景的研究方向。
六味地黄苷糖（LW-AFC)是靠前来源于六味地黄汤，由多糖、寡糖和糖苷三个活性 成分群组成的中药5类新药。前期研宂结果表明，LW-AFC对多种原因所致NIM紊乱具有 明显调节作用，同时具有改善急性应激所致的认知功能损伤和AD模型小鼠学习记忆能力 的作用。但是对于LW-AFC能否改善慢性应激所致的情绪和认知损伤，尚不明确。
因此，本课题根据**应激源的多样性和应激反应的复杂性，针对**应激*常遇到 的问题：饮水缺乏、睡眠剥夺、狭小战斗空间和对未来不可预计的紧张心理，首先建立单 因素应激（空瓶刺激模型、睡眠剥夺应激动物模型、束缚应激动物模型）和慢性多重应激 动物模型模拟这几种应激状态，并观察不同**应激模式和不同**应激负荷对情绪和认 知功能的影响及特点，继而研宄LW-AFC对慢性应激所致焦虑、抑郁样行为及学习记忆能 力损伤的作用，*后探讨LW-AFC改善慢性应激致情绪和认知损伤的作用机制。
**章LW-AFC对单因素应激小鼠情绪的影响
采用不确定性空瓶饮水刺激法、睡眠剥夺应激法和束缚应激法分别模拟**应激中饮 水缺乏、睡眠缺失及狭小空间的常见现象，观察单因素应激对小鼠情绪的影响及LW-AFC 的改善作用。
1.空瓶刺激法对小鼠焦虑样行为的影响
采用每天给予小鼠一次空瓶刺激，lOmin/次，连续14d，建立不确定性空瓶饮水刺激 模型。结果表明，与空白对照组相比，空瓶刺激组和生理应激组小鼠体重在空瓶刺激7 d 和14d后均显著下降；旷场实验结果显示，空瓶刺激小鼠自主活动显著升高，在中央区停 留时间有下降的趋势；高架十字迷宫实验结果显示，定时饮水组小鼠在开放臂内停留时间 显著减少，进入开放臂的次数有下降趋势。与定时饮水组相比，空瓶刺激组和生理应激组 小鼠体重在空瓶刺激7 d后显著下降；旷场实验结果显示，空瓶刺激小鼠自主活动无明显 变化，在中央区停留时间有下降的趋势；高架十字迷宫实验结果显示，空瓶刺激小鼠进入 开放臂的次数和在开放臂内停留时间均无明显变化。上述结果提示，空瓶刺激14d小鼠未 出现焦虑情绪•，单纯性缺水和单笼饲养可对小鼠行为产生较大影响。
2. LW-AFC对睡眠剥夺小鼠焦虑样行为的影响
采用改良平台法对小鼠连续睡眠剥夺96h，建立睡眠剥夺模型。结果表明，与正常对 照组相比，大平台对照组小鼠体重显著下降，提示实验未排除水环境对小鼠体重产生的影 响；与大平台对照组相比，睡眠剥夺组小鼠体重显著下降，LW-AFC对小鼠体重无明显改 善作用。旷场实验结果表明，与正常对照组相比，大平台对照组小鼠在旷场中运动总距离 显著增加，在旷场中央区停留时间无明显变化；与大平台对照组相比，睡眠剥夺小歐在旷 场中运动总距离显著降低，在旷场中央区停留时间显著降低；高架十字迷宫实验结果表明， 与正常对照组相比，大平台对照组小鼠在开放臂中停留时间和进入开放臂的次数均无明显 变化；与大平台对照组相比，睡眠剥夺小鼠在开放臂中停留时间和进入开放臂的次数均显 著降低；LW-AFC具有增加小鼠自主活动、在旷场中央区停留时间和进入开放臂次数的趋 势。上述结果提示，睡眠剥夺小鼠表现出明显的焦虑样行为，LW-AFC对睡眠剥夺小鼠焦 虑样行为具有改善的趋势。
1. LW-AFC对束缚应激小鼠焦虑样行为的影响
采用每天束缚小鼠2 h，连续14 d，建立束缚应激模型。结果表明，与正常对照组相 比，束缚应激7 d和14 d后小鼠体重均有降低的趋势，LW、LW-AFC对小鼠的体重无明 显改善作用。旷场实验结果显示，束缚应激7d小鼠自主活动无明显变化，在旷场中央区 停留时间有下降的趋势；高架十字迷宫实验结果显示，进入开放臂的次数和在开放臂内停 留时间均显著减少；LW及LW-AFC具有增加小鼠在旷场中央区停留时间、进入高架十字 迷宫开放臂的次数和在开放臂内停留时间的趋势。束缚应激14d小鼠自主活动有增加的趋 势，在旷场中央区停留时间无明显变化；进入幵放臂的次数和在开放臂内停留时间均无明 显变化。上述结果提示，束缚应激7 d可诱发小鼠产生焦虑样行为，而束缚应激14 d小鼠 焦虑情绪消失，LW及LW-AFC具有改善束缚应激7 d小鼠焦虑样行为的趋势。
**章LW-AFC对慢性多重应激模型小鼠情绪和认知损伤的影响
采用14种应激条件随机组合，建立慢性不可预知性温和应激（Chronic unpredictable mild stress，CUMS)模型，用于模拟**应激中多种复杂未知因素的刺激。选择氟西汀 (Fluoxetine, FLU)作为阳**，观察CUMS 14 d和CUMS 28 d对小鼠的情绪和学习记忆 功能的改变，评价LW-AFC低剂量（0.8g/kg)、中剂量（1.6g/kg)和高剂量（3.2g/kg)对 其的改善作用，从时效和量效两个方面考察LW-AFC的药效。于造模结束后进行行为学实 验，评价LW-AFC对CUMS模型小鼠焦虑、抑郁样行为及学习记忆能力损伤的影响。
1. LW-AFC对CUMS模型小鼠体重变化的影响
与正常组小鼠相比，应激7、14、21、28 d小鼠体重均显著降低，FLU、LW及LW-AFC对小鼠体重无明显改善作用。
2. LW-AFC对CUMS模型小鼠焦虑样行为的影响
采用旷场和高架十字迷宫实验检测小鼠焦虑样行为。CUMS 14 d后，旷场实验结果显 示，与正常组小鼠相比，模型组小鼠在旷场中运动总距离显著升高，在旷场中央区停留时 间显著降低；高架十字迷宫实验结果显示，模型组小鼠进入开放臂的次数和在开放臂内停 留时间均显著降低。给予FLU后可显著增加模型小鼠进入开放臂的次数，给予LW可增加 模型小鼠在旷场中央区停留时间、进入开放臂的次数和在幵放臂内停留时间的趋势，给予 LW-AFC (3.2g/kg)能够显著增加小鼠在开放臂内停留时间和进入开放臂的次数。CUMS 28 d后，模型组小鼠在旷场中运动总距离显著升高，在旷场中央区停留时间显著降低，进入 高架十字迷宫开放臂次数和停留时间均显著降低。LW-AFC (1.6g/kg)可显著增加小鼠在 开放臂停留时间，FLU和LW具有增加小鼠在旷场中央区停留时间、进入开放臂的次数和 在开放臂内停留时间的趋势。上述结果提示，CUMS 14 d和28 d均可诱发小鼠产生明显的 焦虑样行为，FLU、LW和LW-AFC可以改善CUMS 14 d小鼠焦虑样行为，LW-AFC对 CUMS 14 d和28 d小鼠焦虑样行为均具有改善作用。
3. LW-AFC对CUMS模型小鼠抑郁样行为的影响
采用糖水偏爱实验检测小鼠抑郁样行为。结果表明，与正常组小鼠相比，CUMS 14 d 后，各组小鼠糖水消耗率无明显变化，提示CUMS 14d未诱发小鼠产生抑郁样行为。CUMS 28 d后，模型组小鼠糖水消耗率显著降低，FLU、LW-AFC (3.2g/kg)能显著增加小鼠糖 水消耗率。上述结果提示CUMS 28 d可诱发小鼠产生明显的抑郁样行为，FLU、LW-AFC 均具有改善小鼠抑郁样行为的作用，且与阳**FLU的作用相当，LW具有改善小鼠抑郁 样行为的趋势。
2. LW-AFC对CUMS模型小鼠物体识别记忆的影响
采用新物体识别实验检测小鼠物体识别记忆能力。结果表明，CUMS 14 d后，模型组
小鼠于训练期后1 h对新物体的识别指数无明显变化，于训练期后24 h对新物体的识别指 数有降低的趋势，提示CUMS 14 d对小鼠短时记忆无影响，对小鼠长时记忆有损害的趋势， FLU、LW及LW-AFC均有改善小鼠长时记忆的趋势。CUMS28d后，模型组小鼠于训练 期后1 h对新物体的识别指数无明显变化，于训练期后24 h对新物体的识别指数有降低的 趋势，提示CUMS 28 d对小鼠短时记忆无影响，对CUMS组小鼠长时记忆有损害的趋势， LW及LW-AFC均有改善小鼠长时记忆的趋势，而FLU具有损伤小鼠长时记忆的趋势。
3. LW-AFC对CUMS模型小鼠空间学习记忆的影响
采用水迷宫实验检测小鼠空间学习记忆能力。结果表明，与正常组小鼠相比，CUMS 28 d后，模型组小鼠学习期逃避潜伏期有延长的趋势，LW-AFC (3.2g/kg)具有缩短小鼠逃 避潜伏期的趋势；模型组小鼠测试期逃避潜伏期显著增加，LW-AFC (3.2g/kg)可显著降 低小鼠逃避潜伏期；模型组小鼠穿环次数有降低的趋势，FLU、LW及LW-AFC均有增加 小鼠穿环次数的趋势•，模型组小鼠在目标象限停留时间显著降低，FLU、LW-AFC (0.8、 3.2g/kg)可显著增加小鼠在目标象限停留时间。上述结果提示，CUMS 28d会损伤小鼠的 空间学习记忆能力•，FLU、LW-AFC具有改善CUMS模型小鼠空间学习记忆损伤的作用， LW对小鼠空间学习记忆具有改善的趋势。
第三章LW-AFC改善慢性应激致小鼠情绪和认知损伤作用机制的初步研究
LW-AFC能够改善慢性多重应激小鼠焦虑、抑郁样行为及学习记忆能力损伤，在此基 础上，本研究从HPA轴功能、神经递质及NMDAR-BDNF信号通路等方面探讨了 LW-AFC 发挥抗应激药效的可能作用机制。
1. LW-AFC对CUMS模型小鼠HPA轴功能的影响
采用放射性免yi法和酶联免yi法检测小鼠血浆CORT、ACTH、下丘脑CRH含量。结 果表明，与正常组小鼠相比，CUMS 14 d小鼠血浆中CORT含量显著升高，血浆中ACTH 含量显著降低，下丘脑释放的CRH含量显著降低，FLU、LW及LW-AFC可显著降低血浆 中CORT含量，LW及LW-AFC( 1.6g/kg)可显著升高血浆中ACTH含量，LW-AFC(3.2g/kg) 可显著升高下丘脑释放的CRH含量。CUMS 28 d模型小鼠血浆中CORT含量显著升高， 血浆中ACTH含量显著升高，下丘脑释放的CRH含量显著升高，FLU及LW可显著降低 小鼠血浆中CORT含量，LW及LW-AFC可显著降低小鼠血浆中ACTH含量。上述结果提 示，CUMS会导致小鼠HPA轴功能异常，FLU、LW及LW-AFC对CUMS小鼠HPA轴功 能紊乱具有调节作用。
