神经调节素受体降解蛋白(Nrdpl)在老年大鼠体外循环导致的术后认知功能障碍中的作用及机制研究

摘要

目的：通过建立老年大鼠体外循环（cardiopulmonary bypass，CPB) 导致的术后认知功能障碍（postoperative cognitive dysfunctions，POCD)

模型，初步探讨老年大鼠CPB后POCD及海马神经元凋亡与神经调节 素受体降解蛋白(Nrdpl)的相关性。通过慢病毒构建空载质粒、Nrdpl 过表达及沉默海马神经元细胞，探讨Nrdpl在缺氧复氧模型中对神经 元细胞凋亡的调控作用；并通过基因干扰大鼠海马Nrdpl的表达，在 载体水平探讨Nrdpl对老年大鼠CPB后POCD的影响及其发挥作用的 调控机制是否与Nrdpl泛素化降解底物蛋白ErbB3及下游AKT信号通 路，促进神经元凋亡有关。

方法：

第1部分

选取18月龄SD (Sprague-Dawley，SD)雄性大鼠60只，按照随 机数字表法分为三组（n=20)，即对照组（C组)、假手术组（S组)、 模型组（M组）。建模前对老年大鼠进行为期5天的行为学基线测试及 Morris水迷宫训练。C组做为空白对照组，S组大鼠只做对应的血管结 扎，而未进行CPB，M组为CPB组。通过Morris水迷宫实验观察三 组老年大鼠术后第1、3、7天行为学的改变，包括1.定位巡航实验（测

量逃逸潜伏期和游泳速度)、2.空间探索实验（测量停留时间百分比和 停留路程百分比），以评价CPB对学习、记忆功能的影响。造模结束 后，通过使用酶联免yi附法(Enzyme linked immunosorbent assay， ELISA)检测C、S、M三组大鼠在CPB后第1、3、7天海马组织中炎 因子TNF-a、IL-lp的含量。用Westem-blot实验方法检测C、S、M三 组大鼠CPB后海马组织中Nrdpl、ErbB3、p-AKT、C.Caspase3的表达 水平。通过 TUNEL 染色法（Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling，TUNEL)，分别观察 C、S、M 三组大鼠海马 CA1、 CA3、DG区的神经元凋亡情况，并计算其凋亡指数。

**部分

体外培养海马原代神经元细胞，采用重组克隆技术，在细胞培养 的第5天将慢病毒转染到培养所得的海马原代神经元，构建特异性 Nrdpl过表达组、特异性Nrdpl沉默组以及空载质粒组海马神经元。慢 病毒转染72小时后构建细胞缺氧复氧模型，将海马原代神经元按照随 机数字表法分为5组：空白对照组（C组)、缺氧复氧组（H/R组)、空 载质粒缺氧复氧组(H/R+NC组)、Nrdpl过表达缺氧复氧组(H/R+Nrdpl 组）、Nrdpl 沉默缺氧复氧组(H/R+shNrdpl 组）〇Westernblot检测Nrdpl、 ErbB3、p-AKT、AKT和C.Caspase3蛋白的变化情况。采用MTT法检 测神经元的活性。流式细胞仪检测神经元的凋亡情况。

第三部分

选取18月龄SD雄性大鼠60只。15只大鼠进行预实验，通过颅 脑定位仪将慢病注射大鼠海马CA1区，构建空载质粒、Nrdpl 过表达及沉默大鼠。剩余45只大鼠实施CPB手术，随机分为5 组（n=9):空白对照组（C组）、体外循环组（M组)、空载质粒体外 循环组（M+NC组)、Nrdpl过表达体外循环组（M+Nrdpl组)、Nrdpl 沉默体外循环组（M+shNrdpl组)。通过Morris水迷宫实验观察五组老 年大鼠术后行为学的改变，包括1.定位巡航实验、2.空间探索实验，以 评价CPB对学习、记忆功能的影响。TUNEL荧光染色，观察各组大 鼠海马CA1区的海马神经元凋亡情况。Western blot实验方法检测五组 大鼠在 CPB 后海马组织中 Nrdpl、ErbB3、p-AKT、AKT 和 C.Caspase3 蛋白的变化情况。