摘要: 目的考察灵芝孢子油对慢性轻度不可预见刺激模型小鼠行为学影响及可能的神经生理机制。方法采用13 种不同慢性轻度不可预见刺激对雄性BALB/C 小鼠连续刺激建立小鼠抑郁模型。从第3 周开始连续灌胃给予3 个剂量的灵芝孢子油( 850、283、141. 5 mg·kg － 1 ) ，盐酸氟西汀( 10 mg·kg － 1 ) 或空白溶媒( 植物油) 2 周后，测定各组小鼠行为学变化，同时采用反相高效液相色谱法( ＲP-HPLC) 测定海马谷氨酸( GLU) 和γ-氨基丁酸( GABA) ，酶联**法测定脑源性神经营养因子( BDNF)的含量。结果与模型组比较，灵芝孢子油能增加抑郁小鼠的体重、糖水偏好率和旷场实验得分( P ＜ 0. 01) ，缩短悬尾实验和强迫游泳实验的不动时间( P ＜ 0. 05，P ＜ 0. 01 ) ，明显降低海马GLU 的含量( P ＜ 0. 01) ，增加BDNF 含量( P ＜ 0. 01) ，但对GABA 含量无影响( P ＞ 0. 05) 。结论灵芝孢子油对抑郁模型小鼠表现出明显的抗抑郁作用，其抗抑郁作用可能与其降低GLU 和增加BDNF 相关。
关键词: 灵芝孢子油; 慢性轻度不可预见刺激; 谷氨酸; γ-氨基丁酸; 脑源性神经营养因子
抑郁症( depression，DEP) 主要表现为情绪低落、行为迟缓和悲观厌世等症状，严重者可发生**行为。据世界卫生组织预测，2020 年抑郁症将成为仅次于心血管**的**大疾患。但用于**抑郁症的**如三环类抗抑郁剂、单胺氧化酶抑制剂和5-羟色胺再摄取抑制剂等，均有不同程度的副作用，如嗜睡、视物模糊、高血压、惊厥和**低下等。因此，寻找**、副作用小的抗忧郁药越来越引起人们的重视。
灵芝孢子油( ganoderma spore oil，GSO) 是从灵芝孢子中提取的脂质活性物，含有灵芝孢子的主要有效成分如三萜类、核苷类及部分多糖类化合物等。沈志勇等研究铝中毒小鼠发现，灵芝孢子油提高小鼠的学习记忆水平。但灵芝孢子油在抑郁方面的作用未见报道，本实验目的是了解灵芝孢子油的抗抑郁作用及其可能神经生理学机制。
1 材料
药用植物油( 江西金源天然香料有限公司，批号: 20150116) ; 灵芝孢子油软胶囊( 金华寿仙谷药业有限公司，批号: 20150201，0. 425 g) ，灵芝孢子油化学成分分析由本院天然**所提供: 总三萜含量19. 6%，不饱和脂肪酸占68. 42%; 盐酸氟西汀( fluoxetine，FH，常州四药制药有限公司，批号:20150223) ; 实验前用0. 9%氯化钠注射液配成所需浓度的溶液。
谷氨酸( glutamic acid，GLU) 对照品( 中国药品生物制品检定研究院，批号: 140624-200805，纯度为100. 0% ) ; γ-氨基丁酸( gamma-aminobutyricacid，GABA，美国Sigma 公司，纯度≥99. 0% ，批号: BCBG4279V) ; 正亮氨酸对照品( norleucine，Nle，北京百灵威科技有限公司，纯度: 98% ，批号: L960N22 ) ; 对照品均用甲醇-水( 50∶ 50) 溶解并稀释至所需浓度。异硫氰酸苯酯( 美国Sigma 公司，批号: BCBB1912V) ; 脑源性神经营养因子( brain-derived neurotrophic factor，BDNF)测定试剂盒( 合肥博美生物科技有限责任公司，批号: 201505) 。
XＲ － XZ301 旷场实验分析系统，高30 cm，内径50 cm，被等分为面积相等的25 个等边方格、SuperFst 强迫游泳实验分析系统，规格为直径为15 cm，高度为20 cm、SuperTst 高通量悬尾实验分析系统( 亚搏APP·官方网站（中国）v2.78IOS下载/Android通用版/手机APP) ;LC － 20AT 液相色谱系统( 包括自动进样器、紫外检测器和工作站) ( 日本岛津) ; X － 22Ｒ Centrifuge型高速低温离心机( 美国Beckman 公司) ;TOLED0320 酸度计( 瑞士Mettler 公司) ; IKA T10匀浆机( 德国IKA 公司) 。
2 方法
2. 1 实验动物及分组
健康雄性BALB /C 小鼠60 只，20 ～ 22 g［上海斯莱克实验动物有限责任公司，合格证号SCXK( 沪) 20120002］。平衡饮食3 d 后随机分为: ①空白对照组( blank) : 不刺激，并ig 给予药用植物油; ②模型组( chronic unpredictable mild stress，CUMS) : 13种慢性刺激制作慢性轻度不可预知刺激模型( CUMS) ，并ig 给予药用植物油; ③ 高剂量组( CUMS + GSO-H) : CUMS，并ig 给予灵芝孢子油850mg·kg － 1·d － 1 ) ; ④中剂量组( CUMS + GSO-M) :
CUMS，并ig 给予灵芝孢子油283 mg·kg － 1·d － 1 ;⑤低剂量组( CUMS + GSO-L) : CUMS，并ig 给予灵芝孢子油141. 5 mg·kg － 1·d － 1 ; ⑥阳性对照组:CUMS，并ig 给予氟西汀10 mg·kg － 1·d － 1。均常规饮水，造模第3 周开始给药，连续给药14 d。**给药剂量根据本实验室前期实验获得。
2. 2 慢性轻度不可预见应激模型的建立本实验采用Willer［5］抑郁模型方式造模。正
常组除外的5 组，每日给予不可预见应激刺激，包括18 h 食物剥夺、4 h 噪音、10 min 闪光、15min 热刺激( 45 ℃) 、2 h 制动、5 min 冷冻( 4℃) 、15 min 摇晃( 频率1 次·s － 1 ) 、18 h 湿笼( 100 mL 水) 、1 min 夹尾、16 h 饮水剥夺、5 min游泳( 25 ℃) 、20 次电击( 30 V，30 s) 、24 h 异物，以上刺激每天随机安排1 种，同种刺激在整个实验周期中可出现多次，但不能连续出现，使动物不能预知刺激的发生，14 d 1 个循环，共造模28 d。每周测体质量1 次。
2. 3 旷场实验( open field test，OFT)
在末次灌胃给药1 h 后，每组取10 只动物，在室温为25 ℃的安静实验室内将小鼠小心放在自发活动旷场箱底中心，观察5 min 内活动情况。观察指标为: ① 水平穿行方格数: 3 爪以上跨入邻格或者重心落入; ② 竖直站立次数: 前肢离开水平地面1 cm 以上的次数。分别计算水平运动得分、垂直运动得分。每次做完实验后清理箱内残留物，**上1 只大鼠的气味，以免影响下1只大鼠的行为。
2. 4 糖水偏好实验( sucrose preference test，SPT)
实验开始前，在安静的房间内先训练小鼠适应含糖饮水: 每笼同时放置2 个水瓶，第1 个24 h，2瓶均装有1% 的蔗糖水; 第2 个24 h，一瓶装有1%蔗糖水，另一瓶装有蒸馏水。禁食禁水10 h 后，进行小鼠的蔗糖饮水实验。同时给予每组小鼠事先定量好的1 瓶1% 蔗糖水，1瓶蒸馏水。1 h 后，取走2瓶水称重，记录每组的蔗糖水消耗量、蒸馏水消耗量以及总液体消耗量。于实验的第7、14、21、28 天各测量1 次。蔗糖水偏好度( %) = ( 蔗糖水消耗量/总液体消耗量) × 100%。
2. 5 小鼠尾悬挂实验( tails suspension test，TST)
于末次灌胃给药l h 后，每组取10 只动物，在安静无风的室内，将小鼠尾部距末端约2 cm 处，用医用胶布粘贴固定在悬尾仪上，使小鼠呈倒挂状态，两侧有黑色挡板隔开，遮挡小鼠视线，使其不受外界干扰悬挂6 min，记录后4 min 内小鼠累计不动时间( 指小鼠停止挣扎，身体呈垂直倒悬状态，静止不动) 。
2. 6 强迫游泳实验( forced swimming test，FST)
于末次灌胃给药l h 后，每组取10 只动物，将小鼠单独放入强迫游泳仪的圆柱形玻璃缸中，缸内水深10 cm，水温( 25 ± 2) ℃，从小鼠入水后计时6min，记录后4 min 内游泳累计不动时间( 指小鼠在水中停止挣扎，或显示漂浮状态，仅有微小的肢体运动以保持头部浮在水面) 。每只动物做完后即换水。
2. 7 脑组织处理
冰浴下分离小鼠脑海马，**称重后1∶ 10 加入生理盐水，冰浴下超声裂解30 s; 在2 500 r·min － 14 ℃低温离心30 min，取上清液0. 5 mL，加含100μmol·L － 1内标液2. 0% 高氯酸1 mL 混匀，14 000r·min － 1 4 ℃低温离心30 min，取上清液作为样品溶液。
2. 8 海马脑源性神经营养因子含量测定
将海马组织于4 ℃复温，按1∶ 9 比例加入预冷50 mmol·L － 1醋酸缓冲液( pH 4. 75) ，匀浆后静置5min，3 500 r·min － 1离心15 min，收集上清液作为样品，按试剂盒说明测定。
2. 9 衍生剂配制及柱前衍生
衍生试剂为1 mol·L － 1 的三乙胺乙腈溶液: 取三乙胺139 μL，加乙腈861 μL，混匀; 0. 1 mol·L － 1异硫氰酸苯酯乙腈溶液: 取异硫氰酸苯酯12 μL，加乙腈988 μL，混匀。柱前衍生取氨基酸对照品溶液及样品溶液200 μL，分别置1 mL 离心管中，加正亮氨酸内标溶液( 100 μmol · L － 1 ) 10 μL，加入1 mol·L － 1三乙胺乙腈溶液100 μL，0. 1 mol·L － 1异硫氰酸苯酯乙腈溶液100 μL，混匀，室温放置1h，加入400 μL 正己烷，放置10 min，取下层溶液，用水稀释10 倍，用0. 45 μm 滤器过滤，进样10 μL;色谱条件: 色谱柱为Inertsil ODS-3 色谱柱( 4. 6mm × 250 mm，5 μm) ; 柱温为40 ℃; 检测波长为254 nm; 进样量为10 μL; 流动相A 为0. 1 mol·L － 1醋酸钠溶液( 用乙酸调节pH 为6. 5) -乙腈( 95∶ 5) ，流动相B 为乙腈-水( 80 ∶ 20) ，梯度洗脱程序0 ～ 2min，100% A; 2 ～ 15 min，100% →90% A; 15 ～ 25min，90% →70% A; 25 ～ 33 min，70% →55% A;33 ～ 43 min，0% A; 43 ～ 53 min，100% A。
2. 10 统计学处理
实验数据以均数± 标准差表示。数据用孙瑞元DAS 软件进行单因素方差分析后，再进行各组间均数两两比较分析，P ＜ 0. 05 表示差异有统计学意义。
3 结果
3. 1 灵芝孢子油对小鼠体重的影响与正常组比较，小鼠造模在第2 到3 周后体
重增加缓慢，第4 周甚至出现下降( P ＜ 0. 05，P ＜ 0. 01) ，说明小鼠在抑郁形成的过程中，可能影响消化系统功能，从而导致体重减轻。与模型组比较，阳性组和灵芝孢子油高剂量组小鼠的体重在3、4 周增加( P ＜ 0. 05，P ＜ 0. 01 ) ，在4 周时，小鼠的体重也都得到明显改善( P ＜ 0. 05 ) ，结果见表1。
3. 2 灵芝孢子油对蔗糖水偏好的影响
与正常组比较，模型组和各给药组小鼠造模14d 其糖水偏好率降低( P ＜ 0. 05) ，模型组在第3、4 周其糖水偏好率降低更显著( P ＜ 0. 01 或0. 05) 。但给药组小鼠在28d，除低剂量组偏低外，高、中剂量组基本达到正常组水平。与模型组相比，各给药组和阳性对照组小鼠14 d 差别没有统计学显著性，但在第3、4 周其糖水偏好率明显增高( P ＜ 0. 01 或0. 05) ，高剂量组基本达到阳性对照组水平，结果见表2。
3. 3 灵芝孢子油在小鼠旷场实验的得分情况
与正常组比较，模型组小鼠旷场实验得分显著性降低( P ＜ 0. 01) 。与模型组相比，高、中剂量组和阳性对照组小鼠敞箱实验得分增加( P ＜ 0. 01 或P ＜ 0. 05) ，高剂量组基本达到阳性对照组水平。
3. 4 灵芝孢子油对小鼠悬尾实验的不动时间的影响
与正常组比较，模型组小鼠悬尾实验不动时间明显延长( P ＜ 0. 01) 。与模型组相比，各给药组和阳性对照组小鼠悬尾实验不动时间缩短( P ＜ 0. 01或P ＜ 0. 05) 。结果见表3。
3. 5 灵芝孢子油对小鼠强迫游泳试验不动时间的影响
与正常组比较，模型组小鼠强迫游泳试验不动时间明显延长( P ＜ 0. 01) 。与模型组相比，各给药组和阳性对照组小鼠强迫游泳试验不动时间缩短( P ＜ 0. 01) ，高、中剂量组基本达到正常水平，结果见表3。
3. 6 灵芝孢子油对小鼠海马GLU、GABA 和BDNF的影响
与空白组比较，抑郁模型组大鼠海马组织的GLU 含量升高，有明显统计学差异( P ＜ 0. 05 ) ，BDNF 含量明显降低( P ＜ 0. 01 ) ，GABA 含量变化不明显( P ＞ 0. 05 ) 。与抑郁模型组比较，各给药组和阳性对照组小鼠GLU 含量明显降低( P ＜ 0. 01，P ＜ 0. 05 ) ，BDNF 含量明显升高( P ＜ 0. 01) ，高剂量组基本达到阳性对照组水平; 各给药组和阳性对照组小鼠GABA 变化不明显( P ＞ 0. 05) ，结果见表4。
4 讨论
在本次实验中，给予抑郁小鼠灵芝孢子油后发现，灵芝孢子油能增加抑郁小鼠的糖水偏好率和敞箱实验得分，缩短TST 和FST 的不动时间，其效果与经典的抗抑郁药盐酸氟西汀类似。这个结果表明灵芝孢子油具有抗抑郁作用。
本次实验中发现，模型组海马GLU 含量明显增加，BDNF 含量明显降低，证实了GLU 和BDNF 在抑郁中的作用，这个结果与文献报道基本一致，这说明抑郁的发生与神经***密切相关。同时分析了抑制性神经递质GABA 含量的变化情况，在各实验组均没有发现有统计学差异，这个结果支持Petty的结论。
在给予抑郁小鼠灵芝孢子油后发现，灵芝孢子油能明显降低海马GLU 含量，增加BDNF 含量，这个结果说明灵芝孢子油可能通过降低脑内GLU 水平，从而降低兴奋毒性，减少海马神经元损伤。另外，灵芝孢子油增加BDNF 含量，促进神经元再生，保护神经元存活，有效防止发生神经退行性病变，从而降低抑郁的发生。关于灵芝孢子油影响GLU 和BDNF 的机制，我们分析了灵芝孢子油的化学成分，总三萜含量19. 6%，不饱和脂肪酸占68. 42%。三萜类化合物能够减少脑内Glu。因而推测灵芝孢子油的降低海马GLU 可能与其所含的三萜类化合物有关。长链多不饱和脂肪酸能促进神经祖细胞增殖。因而推测灵芝孢子油的增加BDNF 含量与其所含的多不饱和脂肪酸有关。
综上所述，本实验**证实了灵芝孢子油具有抗抑郁作用，其抗抑郁作用可能是其通过降低抑郁小鼠海马GLU 水平和增加BDNF 水平来发挥作用。
