【摘 要】 目的 探讨复方制剂参益**片改善记忆作用的药效学及其作用机制。方法 采用水迷宫试验、避暗实验、跳台实验观察空白对照组、阳性对照组、复方制剂参益**片高( 1. 607 g/kg) 、中( 0. 536 g/kg) 、低( 0. 269 g/kg) 剂量组对小鼠改善记忆的作用; 采用荧光法对小鼠脑内 5-羟色胺( 5-HT) 、多巴胺( DA) 、去甲肾上腺素( NE) 进行含量测定，初步研究复方制剂参益**片改善小鼠记忆的作用机制。结果 避暗试验中剂量组、高剂量组小鼠的潜伏期明显延长( P＜0. 05) ，错误次数、进入暗室的动物数也明显减少( P＜0. 05) ; 水迷宫试验高剂量、中剂量组小鼠 2 min 内到终点的动物明显增加( P＜0. 05) ; 跳台试验潜伏期有明显延长作用( P＜0. 05) ; 脑 5-HT、DA、NE 含量与空白组比较显著增加。结论 复方制剂参益**片具有明显改善记忆的功能，其机制可能与 5-HT、DA、NE 的相互调节有关。
〔关键词〕 参益**片; 学习记忆; 5-羟色胺; 多巴胺; 去甲肾上腺素
参益**片是在参芪五味子片的基础上，结合文献报道按照中医理论设计而成的**，由人参、五味子、酸枣仁、益智四种中药材组成。人参和益智仁为益智**的常用药，酸枣仁具有养心**、敛汗的功效，它不仅是****不寐之药，还能滋补强壮，久服能养心健脑; 加用五味子，有酸敛收涩、**生津等功效，善治心肾两经的虚亏或不调引起的心神不安、惊悸**等。但复方制剂是否具有明显的改善记忆、**催眠的作用未见报道。本文主要对复方制剂参益**片改善记忆作用进行药效学研究，并探讨其作用机制。
1 材料与方法
1. 1 实验药品及试剂 复方制剂参益**片，自制。含生药量 2 g/片( 所需药材均购于长春市宏检大药房) ; 枣东**颗粒( 北京优你特药业有限公司) 批号: 130501; 实验所需**均以蒸馏水配制所需浓度。酸性正丁醇、正庚烷、邻苯二甲醛-盐酸溶液、碘试液、半胱氨酸溶液、p H7. 2 的磷酸盐缓冲液( PBS) 、乙二胺四乙酸( EDTA) 试液。
1. 2 动物 健康昆明鼠种( KM) ，18 ～ 22 g，雌雄各半，购于吉太小动物用品经销处: 受试小鼠引进后置于长春中医药大学动物实验室饲养。温度: ( 20±3) ℃ ，相对湿度: 50% ～ 70% 。
1. 3 实验仪器 AL 204 万分之**平( 梅特勒-托利多仪器( 上海) 有限司) ; Cary Eclipse 分子荧光光度计( 郑州中谱仪器设备有限公司) Ｒ205 恒温水浴锅( 上海申生科技有限公司) ;T18 basic 组织匀浆仪(广州仪科实验室技术有限 公司) ;KQ3200DB 数控超声清洗器( 广州仪科实验室技术有限公司) ;XR-3TB型跳台实验仪器(亚搏APP·官方网站（中国）v2.78IOS下载/Android通用版/手机APP) ;XR-XB110小鼠避暗实验仪器(亚搏APP·官方网站（中国）v2.78IOS下载/Android通用版/手机APP) ; Morris 水迷宫实验系统( 亚搏APP·官方网站（中国）v2.78IOS下载/Android通用版/手机APP) 。
1. 4 方法 将 50 只小鼠随机分为空白对照组、阳性对照组、高剂量组( 1. 606 5 g/kg) 、中剂量组( 0. 535 5 g/kg) 、低剂量组( 0. 267 8 g/kg) ，3 个剂量组分别灌胃给药参益**片，空白对照组给予等量生理盐水，阳性对照组给予枣东**颗粒，灌胃15 d 后，开始对各组小鼠进行训练并测定。
1. 4. 1 跳台试验 分别将小鼠放在绝缘平台上(通过Supersdt软件实时记录) 。记录第 2 次跳下平台的潜伏期、3 min 内的跳下平台的错误次数和各组跳下台的动物数。训练 3 d 后开始测试。
1. 4. 2 避暗实验 将小鼠置于电击室，背对洞口，先给予条件刺激( 灯光) 15 s
，在亮灯 10 s 后开始通电 5 s( 电击强度为0.2mA) 。记录每只小鼠进入暗室的潜伏期、5 min 内进入暗室错误的次数和各组进入暗室的动物数。并计算 5 min内进入暗室( 错误反应) 的百分率，训练 5 d 后开始测试。
1. 4. 3 水迷宫实验 从训练第 1 天开始，每批实验各有 1 只小鼠给药，平行操作，5 min 后再给**批小鼠注射，以此类推。每天训练 4 次，每次随机选择一个入水点，观察并记录小鼠寻找并爬上平台的路线图及所需时间( 潜伏期)
。4 次训练小鼠分别从 4 个不同的入水点入水，如果小鼠在 120 s 内未找到平台，需将其引至平台。这时潜伏期计为 120 s，每次训练间隔60 s，以 4 次的平均时间及路程作为每天的训练成绩，连续训练5 d后开始测定。
1. 4. 4 复方制剂参益**片片对小鼠脑内单胺类神经递质去甲肾上腺素( NE) 、多巴胺( DA) 、5-羟色胺( 5-HT) 的影响。
1. 4. 4. 1 脑组织 NE 含量测定 上述实验小鼠 50 只，断头取脑，将脑组织用冰生理盐水清洗后吸干水分，天平称取小鼠大脑重量，将小鼠大脑沿脑中线切开，取左半脑组织加入2 ml酸性正丁 醇 后 匀 浆，2 500 r/min 离 心 5 min，分 别 取 上 清 液0. 4 ml，加正庚烷 0. 8 ml，加 0. 1 mol / L 的 HCl 0. 2 ml
超 声1 min，2 500 r / min 离心 5 min 分别取底层水相。水相 50 μl，加PBS 150 μl加 EDTA 40 μl，加新配制的碘液 20 μl，混匀，静置3 min，分别加碱性磷酸钠40 μl，混匀，静置 3 min，分别加醋酸40 μl，混匀，80℃
水浴 10 min，冷却即得。吸取各样品 200 μl 置96 孔板内，进行含量测定，激发波长 382 /488。
1. 4. 4. 2 脑组织中 DA 的含量测定 上述实验小鼠 50 只，断头取脑，将脑组织用冰生理盐水清洗后吸干水分，天平称取小鼠大脑重量，将小鼠大脑沿脑中线切开，去左半脑组织加入2 ml酸 性 正 丁 醇 后 匀 浆，分 别 取 上 清 液 0. 4 ml，加 正 庚 烷0. 8 ml，加 0. 1 mol / L 的 HCl 0. 2 ml 超声 1 min，2 500 r / min 离心5 min分别取底层水相。水相 50 μl，加 PBS 150 μl 加 EDTA40 μl，加新配制的碘液 20 μl，混匀，静置 3 min，分别加碱性磷酸钠
40 μl，混匀，静置 3 min，分别加 5 mol/L 醋酸 40 μl，混匀，100℃ 水浴15 min，冷却即得。精密吸取各样品 200 μl 置 96 孔板内，进行含量测定，激发波长为 325 /385。记录结果。
1. 4. 4. 3 脑组织中 5-HT 的含量测定 上述实验小鼠 50 只，断头取脑，将脑组织用冰生理盐水清洗后吸干水分，天平称取小鼠大脑重量，将小鼠大脑沿脑中线切开，去左半脑组织加入2 ml酸 性 正 丁 醇 后 匀 浆，分 别 取 上 清 液0. 4 ml，加 正 庚 烷0. 8 ml，加 0. 1 mol / L 的 HCl 0. 2 ml 超声 1 min，2 500 r / min 离心 5 min 分别取底层水相。取水相 0. 4 ml，加入 0. 25% 半胱氨酸( 新配) 0. 1 ml，再加入 0. 002% OPT-10 NHCl 3 ml。混匀，沸水浴10 min，冷却即得。精密吸取各样品 200 μl 置 96 孔板内，进行含量测定，激发波长为 368 /480。
1. 5 统计学方法 采用 SPSS17. 0 统计软件进行 t 检验。
2 结 果
2. 1 复方制剂参益**片跳台实验结果 阳性对照组、中剂量组潜伏期与错误次数与空白对照组比较显著差异( P＜0. 05或 P＜0. 01) ，高剂量组潜伏期与错误次数与空白对照组比较有极显著性差异( P＜0. 01) 。
2. 2 复方制剂参益**片避暗实验结果 中剂量组错误次数与空白对照组比较有显著差异( P＜0. 05) ，高剂量组、阳性对照组错误次数与空白对照组比较有极显著性差异( P＜0. 01) ，其他4 组测试潜伏期与空白对照组比较均有增长。
2. 3 复方制剂参益**片水迷宫实验结果 中剂量组、高剂量组实验完成时间〔( 69. 84±23. 37) s、( 65. 45±22. 98) s〕与空白对照组〔( 114. 82±7.96) s〕比较差异显著( P＜0. 05) 。阳性对照组为( 101. 72±26. 32) s，低剂量组为( 80. 50±27. 65) s。
2. 4 小鼠脑内单胺类神经递质测定结果 高、中剂量组脑内 5-HT、DA、NE 含量与空白对照组比较显著增加( P ＜0. 05) ，低剂量组与空白对照组比较均升高，但无显著差异( P ＞0. 05) 。
3 讨 论
参益**片选取了四味常用的中药进行配伍，通过避暗试验、跳台试验、水迷宫试验可以看出无论是错误次数还是潜伏期给药组都有所改善，其药效与阳性对照药对比药效相当，因而从药效学角度看来，参益**片的改善学习记忆作用可以得到较充分的肯定，有较好的益智作用。单胺类神经递质包括儿茶胺和吲哚胺两类，前者包括 DA、NE 和肾上腺素，后者为 5-HT，大脑皮质、纹状体中存在大量的DA 和 5-HT 能神经末梢，他们对**活动如感情、学习、记忆起重要作用
。DA 含量下降是脑功能衰老的表现之一，学习记忆增强常伴有 NE、DA 的增加但对 5-HT 的报道还不是特别明确。参益**片片改善小鼠学习记忆能力可能与 5-HT、DA、NE的相互调节有关。相关文献报道，神经**内的 DA 代谢会影响 NE
的代谢，NE 可能调节广泛脑区的突触传入活动，增大环境中有意义的信息传入，而抑制其他传入刺激的干扰，从而提高注意力，增强学习能力。
本实验采用荧光法对神经递质的含量进行测定用于研究改善记忆的作用机制，荧光法与液相色谱法进行比较，荧光法实验能提高实验效率，目前试剂盒的应用也越来越广泛，可以在后续的机制研究试验中进行优选。
