摘要: 目的 测评环境相关恐惧模型大鼠的行为学变化及疏肝清热健脾法的干预效果。方法 以环境相关恐惧刺激法建立广泛性焦虑大鼠模型，造模同时进行**干预，应激结束后以高架十字迷宫试验进行测评，评价该模型的行为学变化及疏肝清热健脾法的干预效果。结果 造模结束后的大鼠易激惹，运动活力降低，高架十字迷宫测试开放臂活动次数及时间减少，封闭臂活动倾向增多。**组比模型组整体运动活力提高，开放臂活动次数及时间增多，封闭臂活动倾向减少。结论 环境相关恐惧模型大鼠的行为学表现出明显的焦虑，能够较好模拟广泛性焦虑的发病状态，疏肝清热健脾法可降低该模型大鼠的焦虑水平。
关键词: 环境相关恐惧模型; 广泛性焦虑障碍; 行为学; 疏肝清热健脾; 大鼠
焦虑症是一类以恐惧、担忧、紧张不安等焦虑情绪为核心症状的神经症，主要包括急性发作的惊恐障碍( Panic disorder，简称 PD) 和慢性病程的广泛性焦虑障碍( generalized anxiety disorder，简称 GAD)。
随着现代社会生活节奏的加快，GAD 的发病日趋普遍。其慢性病程、易复发、影响生活质量等特点，对人类身心健康的危害较大，因而对 GAD 的发病机制、防治措施开展深入研究**必要性和紧迫性。本研究用环境相关恐惧应激方法建立广泛性焦虑大鼠模型，并通过对大鼠行为学变化的观察、测评，对中药疏肝清热健脾法的干预作用进行探讨。
1 实验材料
健康 Wistar 雄性大鼠 48 只，SPF 级，10 周龄，体质量( 200 ±10) g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，合格证号: SCXK( 京) 2010-0001。动物购进后饲养于 SPF 级实验动物中心，自由摄食饮水，光照节律12L/12D( 6: 00 ～18: 00) ，室温( 20 ±2) ℃，相对湿度 50% ～60%，保持安静。高架十字迷宫( 开放臂 50 cm ×10 cm，闭合臂 50 cm × 10 cm × 40 cm，中央区 10 cm ×10 cm) 由亚搏APP·官方网站（中国）v2.78IOS下载/Android通用版/手机APP生产，产品型号为: XＲ-XG201。Xmaze 实验动物行为学视频分析系统，由亚搏APP·官方网站（中国）v2.78IOS下载/Android通用版/手机APP生产，与高架十字迷宫设备配套。声电刺激仪，由上海软隆科技发展有限公司生产。丹栀逍遥散( 柴胡 15g，栀子10 g，牡丹皮 10 g，炒白术 15 g 等) 购于北京中医药大学第三附属医院，造模前按大鼠用量 10. 5 g/ ( kg·d) ，灌胃剂量每次 2 mL 煎煮，煎取后浓缩至生药浓度 1. 05 g/mL，贮存于 4 ℃冰箱冷藏备用，灌胃前以温水隔水加热。盐酸丁螺环酮( 商品名: 一舒，江苏恩华药业股份有限公司，批准文号: 国药准字H19991024) ，按**用量 20 mg / ( 70 kg·d) 的 7 倍、灌胃剂量每次2 mL计算大鼠用量 2．0 mg/( kg·d) ，以浓度0．20 mg/mL 溶于蒸馏水中，灌胃前混匀。
2 实验方法
2. 1 动物分组与给药 动物预养 1 周后，首先将 48只动物进行旷场试验，以水平运动总格数与直立次数( 垂直运动) 之和为参考，按正态分布去掉置信区间95% 以外的大鼠 8 只，剩余 40 只大鼠按水平运动与垂直运动之和随机分为正常组、模型组、对照组、**组，每组 10 只。自造模第 1 天起，正常组不予任何处理，自由摄食、饮水，模型组予以蒸馏水灌胃，对照组予以丁螺环酮水溶液灌胃，**组予以中药丹栀逍遥散浓缩药汁灌胃，连续 21 d。
2. 2 模型制备 动物预养及分组结束后，模型组、对照组、**组与灌胃同步进行环境相关恐惧模型的制备。本模型制备分 3 个阶段进行应激，第 1 阶段为条件性训练( 1 d) ，给予大鼠条件性刺激，程序为“无刺激 180 s→声音信号 30 s→足底电击 2 s→无刺激20 s”，训练 10 次; 第 2 阶段为环境相关( 2 d) ，将大鼠放入**阶段环境中，评价环境相关的条件性恐惧程度，程序为“无刺激180 s”; 第3 阶段为改变的环境信息( 2 d) ，改变环境信息后观察大鼠的条件性恐惧程度，程序为“无刺激 180 s→声音信号 180 s→无刺激6 s”。以上流程循环 4 次，共 20 d。声电刺激仪设定电流为 1. 2 mA，声音信号采用“滴滴”样相同频率声音。模型制备同时，观察并记录大鼠僵滞时间，僵滞时间记录由 3 名观察者观察结果平均而得。模型制备期间，3 组大鼠的应激操作于每天 8: 00 ～ 11: 30进行，应激前大鼠提前 30 min 进入应激实验室适应环境，操作时抓取动物轻柔。
2. 3 高架十字迷宫测试 行为学实验室保持安静通风，恒温 22 ℃，湿度 50% ～60%，室内暗光，光线自天花板反射到高架十字迷宫测试区。迷宫由两个开放臂( 50 cm × 10 cm) 、两个封闭臂( 50 cm × 10 cm × 40cm) 、一个连接四臂的中央平台( 10 cm × 10 cm) 组成，开放臂与封闭臂互相垂直成十字形。测试前动物提前60 min 进入房间适应环境，测试时实验人员轻柔抓取大鼠并迅速轻放入 EPM 中央平台处，放置时使大鼠头部正对其中一个开放臂，每只大鼠测试时间 5 min，各组交叉进行，测试时摄像视频系统记录大鼠行为表现，实验人员可通过显示器观察大鼠迷宫上的活动，每只大鼠测试结束后将排泄物**干净，并以酒精擦拭迷宫底部，以免影响下只大鼠行为表现。高架十字迷宫测试于造模结束次日 15: 00 ～18: 00 进行，所有大鼠测试结束后，统一分析视频，记录并整理大鼠进入开放臂次数、进入开放臂时间、进入封闭臂次数、进入封闭臂时间、探头次数、直立次数、修饰次数、排便次数，并计算进入开放臂与封闭臂次数之和、开放臂次数占总次数百分比、开放臂时间占总时间百分比。
2. 4 统计方法 数据采用 SPSS 18. 0 统计软件分析处理，各组数据用均数 ± 标准差(珋x ± s) 表示。组内比较用重复测量方差分析，组间比较采用单因素方差分析，方差齐性，验后多重比较采用 LSD 法，以P ＜0. 05表示差异有统计学意义。
3 实验结果
3. 1 造模期间恐惧消退观察 模型制备过程中，模型组、对照组、**组在每个流程中均表现出电击刺激撤除后的恐惧消退，模型组、对照组、**组僵滞时间占总时间百分比第 2，7，12，17 天组间比较无差异;对照组僵滞时间占总时间百分比第 4，5，8，9，10，13，14，15，18，19，20 天比模型组减少( P ＜ 0. 05，P ＜ 0. 01) ，**组僵滞时间占总时间百分比第 8，9，10，13，14，15，18，19，20 天比模型组减少( P ＜ 0. 05，P ＜ 0. 01) ;**组僵滞时间占总时间百分比与对照组比较，第2，3，4，7，12，15，17，18，19，20 天差异无统计学意义，第 5，8，9，10，13，14 天**组高于对照组( P ＜0. 05，P ＜ 0. 01) 。对照组从第 1 个流程开始( 第 4 天起) 表现出僵滞时间较模型组有差异，**组从第 2 个流程开始( 第 8 天起) 僵滞时间较模型组有差异。结果见图 1。
模型组、对照组、**组组内僵滞时间占总时间百分比流程间的比较显示: 第 2，7，12，17 天( 即每个流程第 2 天) 、第 3，8，13，18 天( 即每个流程第 3 天) 、第4，9，14，19 天( 即每个流程第4 天) 及第 5，10，15，20天( 即每个流程第5 天) 比较差异均无统计学意义。
3. 2 造模结束后一般情况及体质量变化观察 造模结束后肉眼观察 4 组大鼠神态、毛发、饮食、粪便性状，结果见模型组、对照组、**组大鼠较正常组大鼠神态懒倦，毛发无光泽，饮食欠积极，活动欠活跃，易激惹，少数大鼠见溏便。且 3 组大鼠与正常组大鼠对比之差别以模型组尤甚，对照组及**组次之。造模第 1，2，3 天 4 组大鼠体质量无差异，自第 4 天起至造模结束，正常组与模型组、对照组、**组比较有差异( P ＜0. 05，P ＜0. 01) ，其中自第 8 天起差异明显，正常组高于其余 3 组( P ＜0. 01) 。对照组与模型组第 9天起 至 造 模 结 束 有 差 异，对 照 组 高 于 模 型 组( P ＜0. 05，P ＜0. 01) ，**组与模型组第 7 天起至造模结束有明显差异，**组高于模型组( P ＜ 0. 01) 。**组与对照组比较第 9 天起至造模结束有差异，**组高于对照组( P ＜ 0. 05，P ＜ 0. 01) ，且第 13 天起至造模结束有明显差异( P ＜0. 01) 。结果见图 2。
3. 3 高架十字迷宫测试 与正常组比较，模型组、对照组、**组开闭臂活动总次数、开臂活动次数所占比例、开臂活动时间所占比例均减少 ( P ＜ 0. 05，P ＜ 0. 01) 。对照组开闭臂活动总次数、开臂活动次数所占比例、开臂活动时间所占比例比模型组增多( P ＜0. 05，P ＜0. 01) 。**组开闭臂活动总次数、开臂活动次数所占比例、开臂活动时间所占比例比模型组明显增多( P ＜0.01) 。**组开闭臂活动总次数、开臂活动次数所占比例、开臂活动时间所占比例与对照组比较差异无统计学意义。结果见表 1。
与正常组比较，模型组、对照组、**组探头、直立次数均减少( P ＜ 0. 05，P ＜ 0. 01) ，修饰、排便次数比正常组增多( P ＜ 0. 05，P ＜ 0. 01) ; 对照组探头、直立次数比模型组增多( P ＜ 0. 05，P ＜ 0. 01) ，修饰、排便次数比模型组减少( P ＜0. 05) ; **组探头、直立次数比模型组明显增多( P ＜0. 01) ，修饰、排便次数比模型组减少( P ＜0. 05) ; **组探头、直立、修饰、排便次数均与对照组比较差异无统计学意义。结果见表2。
4 讨论
环境相关恐惧模型因刺激信号非明确及刺激不可预知被认为可以较好地模拟弥散而持续的焦虑状态，适合作为 GAD 的实验动物模型。该模型制备过程中动物的僵滞时间可反映实验动物条件性恐惧记忆的消退程度。高架十字迷宫试验是经典的可以有效测量实验动物焦虑水平的行为学测试方法。通过对环境相关恐惧模型的制备发现，每个刺激流程大鼠均表现出恐惧记忆的消退，应激后的大鼠易激惹、运动活力降低，高架十字迷宫测试中开臂活动次数及时间相对减少，提示该模型大鼠焦虑状态明显。
中医学没有 GAD 的病名，依据 GAD 的病因及临床表现，将其归属于情志**范畴。依照具体的临床表现，中医辨证认为，该病病位主要在肝、心、脾、肾，病理因素见火、痰、湿、瘀多种，所涉证型有肝郁化火、心肾不交、肝郁脾虚、心脾两虚等，其中肝郁化火证型尤为常见。根据五行“木克土”及“见肝之病，知肝传脾”理论，GAD 属肝郁者往往伴有或引发脾虚，临床所见 GAD 患者往往伴神疲、乏力、倦怠、纳减等脾虚表现，疏肝清热健脾法因而被选作本研究的治法。丹栀逍遥散以逍遥散加牡丹皮和栀子而成方，功可疏肝健脾、清热解郁。
从模型制备过程中对僵滞时间的观察可见，各组在每个流程不同应激阶段的僵滞时间所占百分比组内比较差异无统计学意义，提示大鼠在本模型制备过程中未表现出对恐惧记忆的长期记忆效果，考虑与每个流程条件性训练后的恐惧消退有关。组间比较显示，中药疏肝清热健脾法与丁螺环酮均可降低大鼠处于应激环境中的僵滞时间，提示两者对恐惧记忆的消退均有巩固作用，但疏肝清热健脾法比丁螺环酮起效慢。行为学测评结果显示疏肝清热健脾法与丁螺环酮均可提高该模型大鼠的运动活力，有效降低焦虑水平，并且从行为学各项指标来看，两者干预效果比较差异无统计学意义。但**组高架十字迷宫测试中直立次数的增多均较对照组更明显，且**组体重情况优于对照组，因此认为疏肝清热健脾法具有与丁螺环酮同等的抗焦虑效果，且在大鼠综合体质及精神状态改善方面优于丁螺环酮。李宁等以不确定性空瓶刺激建立 GAD 模型，并以丹栀逍遥散进行干预，结果显示丹栀逍遥散抗焦虑效果优于丁螺环酮，与本研究结果有异，考虑可能与模型应激方式不同有关，另也应与丁螺环酮的给药天数不同而致起效不同有关。
概言之，通过环境相关恐惧应激的方法建立模型，可以造成大鼠明显的焦虑状态，虽然条件性训练阶段电击对实验动物有躯体刺激，但在环境相关恐惧刺激阶段及改变的环境信息阶段均避免躯体应激成分，而且环境信息的不确定性有利于引发动物情绪泛化，易于产生弥散而持续的焦虑，因而较好地模拟GAD 的发病状态。疏肝清热健脾法与丁螺环酮在行为学上均表现出肯定的抗焦虑效果，前者在动物整体体质状态改善方面效果更优。但该模型作为 GAD 实验动物模型具体的神经病理改变仍有待探索，中药的作用机制亦有待更深入的研究。
