【摘要】目的 探讨minocycline抑制炎症反应对血管性抑郁小鼠行为及神经递质的影响。方法 成年雄性CD1小鼠随机分为3组，每组各10只，实验组造模后立即腹腔注minocycline每日1次连续7 d（30 mg/kg），对照组造模后给予同等剂量的生理盐水，假手术组除不阻断颈动脉供血外，其余手术操作与实验组相同，术后同样给予腹腔注射相应剂量的生理盐水。术后第8天起行悬尾实验（第8天）、旷场实验（第9天）检测抑郁行为，水迷宫定向航行实验（第10天）检测认知能力。
1 材料方法
1.1 实验动物分组及模型构建 CD1雄性小鼠30只，周龄10周，体重25～30 g（订购于**军医大学实验动物中心，SPF级），随机分为实验组、对照组和假手术组，每组10只，造模前常规条件下饲养1周。
应用前期实验中采用的反复缺血再灌注法进行制备血管性抑郁小鼠模型。步骤如下：小鼠经腹腔注射0.3%****麻醉成功后，取仰卧位，门齿及四肢固定，剪开颈前皮肤及筋膜，在气管两侧分别分离出左右颈动脉，使用小号动脉夹阻断双侧颈动脉供血5 min后，松开动脉夹恢复供血10 min，再次阻断供血5 min后移除动脉夹，术中密切观察小鼠呼吸、心跳，术毕缝合皮肤，立即腹腔注射minocycline（30 mg/kg），对照组给予腹腔注射等剂量生理盐水，恒温板上复苏，清醒后放回笼中常规饲养。假手术组除不阻断颈动脉供血外，其余手术操作与实验组相同。小鼠手术当日定为术后第1天，术后第1～7天依照不同分组连续注射minocycline及生理盐水每日一次，给药完成后于术后第8天开始行为学检测。前期工作已发表模型组与假手术组行为学检测的结果，在悬尾实验、暗箱实验等抑郁行为检测中发现，模型组动物较假手术组出现明显的抑郁行为，确定动物模型成功。
1.2 行为学检测 抑郁行为学检测包括悬尾实验（tail suspension test，TST）、探洞旷场试验（open-field test）、认知功能检测为Morris水迷宫检测。造模术后第8天开始行为学测试。
TST检测动物的抑郁行为，基于Steru等之前建立的方法稍加改进，采用亚搏APP·官方网站（中国）v2.78IOS下载/Android通用版/手机APP的SuperTst小鼠悬尾系统，安排在术后第8天18∶00～22∶00进行，距尾尖约1 cm处用胶布固定于悬尾系统测试箱的尾钩上，小鼠头部距地面约7.5 cm，关闭测试箱开始计时，共观察6 min，适应2 min，设定软件记录后4 min的小鼠不动时间。与假手术组的小鼠不动时间相比较，当实验组或对照组小鼠不动时间显著延长，可判定为小鼠出现抑郁行为。
探洞旷场试验检测动物的抑郁行为，根据文献中介绍的通用的小鼠分析方法。采用亚搏APP·官方网站（中国）v2.78IOS下载/Android通用版/手机APP的Supermaze动物行为视频跟踪分析系统于术后第9天进行，将小鼠依次放入旷场测试箱（25 cm×25 cm×38 cm）中，测试箱底部有16个圆形小洞，放入小鼠后2 min开始记录，测试时间15 min，记录探洞次数、活动时间与总路程。当实验组或对照组小鼠较假手术组小鼠探洞次数减少、活动时间缩短或总路程减少且差异有显著性时，可判定为该组小鼠出现抑郁行为。血管性抑郁小鼠抑郁行为(悬尾实验)及神经递质的作用
Morris水迷宫检测动物的认知行为，按照文献中对小鼠空间认知检测的方法进行定位航行实验。实验采用亚搏APP·官方网站（中国）v2.78IOS下载/Android通用版/手机APP的Supermaze动物行为视频跟踪分析系统水迷宫装置，水池直径120 cm，高50 cm，维持水温21～22℃，第三象限放置平台，平台置于水面下1 cm，术后第10天开始测试（第9天进行训练，每只小鼠训练4次，每次120 s），随机选择4个象限作为入水点，将动物面向池壁放入水中，同时开始记录小鼠入池至寻找并爬上平台所需时间，即潜伏期（latency），使其在平台上停留20 s后取走，如小鼠在120 s内未找到平台则将其引导上台并停留20 s，记录潜伏期为120 s，计算每只小鼠的平均潜伏期。
2 结果
2.1 minocycline对血管性抑郁小鼠抑郁行为及认知能力的影响 悬尾实验中，实验组、对照组及假手术组的小鼠悬尾不动时间差异具有显著性（F=6.59，P=0.005）（表2），SNK检验显示，与对照组相比，实验组和假手术组悬尾不动时间缩短，差异有显著性，实验组小鼠悬尾不动时间长于假手术组，但两组差异无显著性；探洞旷场实验中，实验组、对照组及假手术组的小鼠探洞次数、活动时间、活动路程差异具有显著性（F=6.17，P=0.008；F=11.55，P＜0.001；F=13.47，P＜0.001），SNK检验显示，与对照组相比，实验组和假手术组探洞次数、活动时间、活动路程均增多，且差异有显著性，实验组较假手术组的探洞次数增多、活动时间减少，但两组间差异无显著性，实验组较假手术组小鼠活动路程减少，且差异有显著性。Morris水迷宫实验中，3组小鼠的潜伏期差异有显著性（F=16.09，P＜0.001），SNK检验显示，与假手术组相比，实验组和对照组潜伏期延长，但两组间相比潜伏期差异无显著性。结果表明，经给予minocycline**处理后，血管性抑郁小鼠的抑郁行为可得到改善，但其认知能力却无明显改善。
2.2 minocycline对小鼠海马组织肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-1β、白细胞介素-6含量的影响 ELISA检测结果显示，实验组、对照组及假手术组小鼠海马组织匀浆中TNF-α、IL-1β、IL-6含量差异均有显著性（F=13.42，P＜0.001；F=18.69，P＜0.001；F=5.49，P=0.010），SNK检验显示，与对照组相比，实验组和假手术组3种促炎性细胞因子均降低，差异有显著性，实验组小鼠海马炎症因子含量稍高于假手术组，但两组差异无显著性。结果显示，minocycline对血管性抑郁小鼠海马组织中3种促炎性细胞因子的表达均有抑制作用。
血管性抑郁小鼠抑郁行为(悬尾实验)及神经递质的作用
2.3 minocycline对小鼠海马组织5-羟色胺、去甲肾上腺素、多巴胺含量的影响 通过对前处理方法的优化，*终选择2%的HClO4生理盐水溶解，以保证3种神经递质的化学稳定性，在此色谱条件下，3种神经递质的色谱峰完全分离，保留时间分别为1.35 min，2.65 min，4.56 min，典型的色谱图如图2所示。其标准曲线方程如表1所示，从结果看出3种化合物在此浓度范围内线性关系良好，相关系数r＞0.9990。海马组织匀浆中3种神经递质含量测定结果显示，3组样本中5-HT、DA的含量差异具有显著性（F=4.17，P=0.026；F=5.18，P=0.012），NE的含量差异无显著性（F=2.13，P=0.139）（图3）。SNK检验显示，与实验组相比，对照组和假手术组5-HT含量差异无显著性，但假手术组5-HT含量高于对照组；与对照组相比，实验组与假手术组DA含量增高，差异具有显著性，但两组间DA的含量差异无显著性。结果表明，minocycline对血管性抑郁模型小鼠海马中5-HT和NE无明显影响，但DA含量增加血管性抑郁小鼠抑郁行为(悬尾实验)及神经递质的作用
3 讨论
1997年Alexopoulos**提出“血管性抑郁”的概念，但脑血管**导致抑郁发生的机
制不明。Alexopoulos分析了一系列临床研究后于2011年提出了血管性抑郁发病机制的“炎症反应假说”，认为年龄及脑血管病相关的炎症过程介导了抑郁症状的发生。
荟萃分析发现，经典的SSRI类抗抑郁**可降低血清中TNF、IL-1β、IL-6水平，TNF-α拮抗剂依那西普和非甾体**药塞来昔布对重症抑郁患者的症状改善具有一定的**效果，但机制仍不明确。尽管****抑郁的研究取得一定进展，但针对血管性抑郁的**干预研究仍然较少。
**代半合成四环素类**minocycline可快速通过血脑屏障，抑制脑内炎症反应，其**作用主要通过直接和间接地抑制**神经系统中小胶质细胞的激活和增殖，进而减少TNF-α、IL-1β、IL-6等细胞因子的释放表达。而前述的炎症反应抑制剂依那西普、塞来昔布仅针对部分炎性细胞因子的表达进行抑制，非特异性**作用不如minocycline**有效。本研究首先观察了给药后海马组织匀浆中的TNF-α、IL-1β、IL-6含量，结果显示给药组3种炎性细胞因子的表达明显减少，表明minocycline可以显著抑制血管性抑郁小鼠海马中炎性细胞因子的表达。
本研究采用前期研究中使用过的血管性抑郁小鼠模型，模拟缺血低灌注损伤所致的血管性抑郁，在前期工作中，本课题组在抑郁行为检测中观察到该模型小鼠较假手术小鼠具有明显的抑郁行为且不伴有神经运动功能缺损，同时在脑组织中观察到以少突胶质细胞减少为特征的脑白质损伤（white matter lesions，WMLs）。而Sneed等研究证实皮层下深部白质损伤是血管性抑郁特征性的神经病理学改变，同时也是血管性抑郁作为老年迟发性抑郁一种亚型的依据。因此，该模型能够有效地模拟血管性抑郁的病理生理状态，是研究血管性抑郁的可靠模型。本研究发现经连续给予minocycline抑制炎症反应后，实验组小鼠抑郁行为较对照组明显改善，进一步验证了TNF-α、IL-1β、IL-6等炎性细胞因子在血管性抑郁发生中的重要作用。
本研究的不足在于，由于用药时间较短，****对动物的认知恢复未观察到明显的效果，仍然不能说明****对认知改善无效。目前针对认知障碍前期——即可逆期的研究成为热点，本研究将进一步进行长程给药与预防性给药对认知功能的影响，为临床防治血管性认知障碍提供依据血管性抑郁小鼠抑郁行为(悬尾实验)及神经递质的作用。
