摘要：目的通过观察微管相关蛋白－２（ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ－２，ＭＡＰ－２）表达的变化研究针灸结合康复法（以后简称针康法）对海马梗死大鼠学习记忆能力的影响。方法将５０只清洁级雄性ＳＤ大鼠随机分为假手术组、模型组、针刺组、针康组和康复组，每组各１０只。采用光化学法诱导大鼠海马梗死造模型，术后２４ｈ给予干预，１４ｄ后采用Ｙ－型迷宫测试，评价各组大鼠学习记忆能力；采用**组化法观察各组大鼠海马中的ＭＡＰ－２表达情况。结果（１）与假手术组比较，其他各组大鼠的学习记忆能力均明显下降，差异具有统计学意义（Ｐ＜０．０５）。在Ｙ－迷宫试验中，与模型组比较，其余各组学习能力均有所恢复，差异具有统计学意义（Ｐ＜０．０５），且针康组优于针刺组和康复组，差异具有统计学意义（Ｐ＜０．０５）。（２）与假手术组比较，各组大鼠的ＭＡＰ－２表达明显，差异具有统计学意义（Ｐ＜０．０５）。与模型组相比其余各组表达更明显，差异具有统计学意义（Ｐ＜０．０５），且针康组优于针刺组和康复组，差异具有统计学意义（Ｐ＜０．０５）。结论针康法可促进大鼠学习记忆能力的恢复、上调ＭＡＰ－２的表达，效果均优于单纯的针刺和康复训练。
关键词：学习记忆；ＭＡＰ－２；针刺；康复训练；脑梗死；大鼠
脑缺血导致患者的运动功能障碍，其功能的恢复可通过再学习而获得，但由于患者多同时存在记忆功能的障碍，严重影响患者提高自身的躯体运动功能，更影响其生活质量。目前，针刺、康复训练**缺血后记忆能力障碍的效果较好，但相关作用机制还不明确。为此，本实验以针刺结合康复训练作为干预手段，探讨针灸结合康复的方法对海马梗死大鼠的ＭＡＰ－２表达和学习记忆能力的影响，并试探性阐述其作用机制。
１ 材料和方法
１．１
实验动物及分组所选试验动物由黑龙江中医药大学实验动物中心提供［许可证号ｓｃｘｋ（京）２００９－０００１］，均为健康清洁级雄性ＳＤ大鼠，共５０只，体重
２００ｇ－２５０ｇ。将大鼠随机分为模型组、假手术组、针刺组、康复组和针刺结合康复组（简称“针康组”），每组１０只大鼠。采用光化学法诱导海马缺血模型。各组于术后２４ｈ进行干预。
１．２
主要仪器、试剂选购于国药集团化学试剂有限公司的虎红粉剂；由哈尔滨工业大学提供的冷光源；上海欣软信息科技有限公司可提供Ｍｏｒｒｉｓ水迷宫、Ｙ－型迷宫；购自美国Ｓｔａｎｔ公司的ＭＡＰ－２一抗试剂盒，产品（批号２００５０７０）；购自北京中山试剂公司的二抗试 剂 盒，产 品 （批 号２００５０１２）。
１．３
制备模型
光化学法诱导法：用１０％水合氯醛按３５ｍｇ／ｋｇ腹腔注射将大鼠麻醉，于俯卧位将大鼠放置在脑立体定位仪上，沿头部正中将大鼠头皮切开，暴露颅骨到前囟点，在前囟点后３．５ ｍｍ、中线向左旁开２．０ｍｍ处，用牙科钻钻开一个直径为１ｍｍ的骨窗，将光纤管尾端探至硬膜下３．３ｍｍ处。用生理盐水稀释虎红，浓度为１．５％，按７０ｍｇ／ｋｇ于腹腔注射，注射时间为２ｍｉｎ。５ｍｉｎ后照射局部海马组织。照射时间５ｍｉｎ。手术结束后缝合头皮，正常喂养。假手术组仅进行常规麻醉（沿头颅切开头皮，用牙科钻在前囟后３．５ｍｍ、中线向左旁开２．０ｍｍ处钻孔，然后缝合头皮）。
１．４
干预方法
针刺组：大鼠术后２４ｈ参照于致顺头部腧穴七区划分法和《大鼠穴位针灸图谱》，选择０．２５ｍｍ×１５ｍｍ针具取顶区进行针刺，进针深度３－１０ｍｍ，留针６ｈ。康复组：大鼠术后２４ｈ进入Ｍｏｒｒｉｓ水迷宫接受训练，从平台所在象限外的其他３个象限，随机选择一个入水点，并记录大鼠寻找并爬上平台的时间，即潜伏期。将大鼠面向池壁放入池中，如果大鼠２ｍｉｎ内找不到平台，就将大鼠放到平台上停留３０ｓ，后将其放回笼中。此种情况潜伏期记为１２０ｓ。训练时依次从３个不同的入水点入水，每次大鼠的入水点相同，训练的顺序固定。每日训练１次。主要训练大鼠的游泳和学习记忆功能能力。针康组：大鼠术后２４ｈ后每日针刺留针６ｈ，Ｍｏｒｒｉｓ水迷宫训练１次。模型组：术后自然恢复，不进行任何干预。
１．５ 标本采集及指标检测
１．５．１
标本采集
干预１４ｄ后，于大鼠检测行为能力后灌注取材。按大鼠０．３５ｍｌ／１００ｇ体重的剂量，腹腔注射１０％水合氯醛０．５ｍｌ，将大鼠深度麻醉，打开胸腔，暴露心脏，将灌注针刺入心尖，沿左心室将管插至主动脉，固定插管，剪开右心耳，先灌注０．９％的生理盐水，见右心耳流出澄清液体，再灌注２００ｍｌ，浓度为４％多聚甲醛固定液。完成灌注后将大鼠断头取脑，所取组织放于４％福尔马林溶液中固定２４ｈ。２４ｈ后乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，切片（从视交叉水平开始进行冠状切片，厚度为５μｍ），采用**组织化学（Ｓ－Ｐ）法染色。
１．５．２
指标检测
将包埋的脑组织切片，石蜡切片先经二甲苯脱蜡，再梯度酒精脱水；取过氧化氢去离子水孵育，以阻断内源性过氧化物酶；枸橼酸微波修复。滴加一抗（１∶５０），４℃下冰箱过夜，ＰＢＳ冲洗，２ｍｉｎ×３次；滴加二抗，３７℃下孵育２０ｍｉｎ，ＰＢＳ冲洗，２ｍｉｎ×３次；滴加ＤＡＢ显色剂；后用蒸馏水进行充分冲洗，苏木素复染，用盐酸乙醇分色、蓝化；后梯度酒精脱水，二甲苯透明，*后中性树胶封片。统计阳性细胞数，将制成切片置于放大镜下（放大倍数为１０×４０）随机选５个视野，显色者为阳性，对每个视野内的阳性细胞数进行统计。
１．６
评估学习记忆能力
采用Ｙ－型迷宫：Ｙ－型迷宫是一个三等臂式迷宫，每臂顶端设有信号灯，将**臂信号灯点亮，危险臂不点亮信号灯。训练中每次无规则选取一**臂。大鼠在通电后从所在臂跑到亮臂记为正确，如跑到暗臂记为错误。每天分段训练大鼠，每段１０次，两段间隔２ｍｉｎ。如连续１０次测试中有９次正确表明大鼠已掌握迷宫结构，记录大鼠掌握迷宫结构所需的训练次，表明学习能力越强的大鼠训练次数越少。以此可判断大鼠学习分辨能力。
１．７
统计方法
采用ＳＰＳＳ １７．０统计软件进行统计学分析，计量资料以均数±标准差（ｘ珚±ｓ）表示，各组组间差异采用单因素方差分析，以Ｐ＜０．０５为有显著性差异。
２ 结果
２．１
学习记忆能力的评估
Ｙ－迷宫试验结果显示，各组大鼠的分辨学习能力明显下降（与假手术组比较），差异有统计学意义（Ｐ＜０．０５）。与模型组比较，干预组学习能力均有所恢复，差异有统计学意义（Ｐ＜０．０５），且针康组疗效*佳，差异有统计学意义（Ｐ＜０．０５），见表１。
２．２
**组化检测海马
ＭＡＰ－２的表达梗死灶周围ＭＡＰ－２阳性细胞明显增多。各组大鼠的ＭＡＰ－２表达较假手术组明显，差异有统计学意义（Ｐ＜０．０５）。与模型组比较，各干预组表达更明显，差异有统计学意义（Ｐ＜０．０５），针康组*佳，差异具有统计学意义（Ｐ＜０．０５），见表２。
３ 讨论
头针作为一种整体性**配合康复**，使患者的大脑皮层在单位**时间内获得更大的刺激量，激发大脑皮层相对无效的或新形成的通路，使原先未承担此功能的结构去承担新的、不熟悉的任务，从而实现对大脑的重塑。临床实践中我们也发现，针灸结合康复之路可同时提高患者的肢体运动能力及认知能力，两方面功能的提高均优于单纯的针灸或康复训练，尤其是头针**（其中以前额部腧穴为主）疗效*为突出。可见，针康法将改善患者肢体运动功能及学习功能，这正符合现代偏瘫康复中的提高运动整合水平的理念。目前，针灸配合运动训练的**方法在临床已取得良好疗效，被称作“新趋势针灸”（ＮＴＡ）。本实验采取术后２４ｈ干预１４天，是因为有研究表明，脑缺血后神经元树突生长发生可能在１周以后，而运动训练对其生长有明显的促进作用。
ＭＡＰ－２是一种热稳定的磷蛋白，哺乳动物脑中含量丰富，是神经细胞的骨架成分，主要在神经元胞体、树突和树突棘表达，能调节微管蛋白组装，是动力学的重要调节因子，常被用来作为神经元的标志蛋白。根据Ｂｒｉｏｎｅｓ等研究发现，短暂性脑缺血后的大鼠的表达增加，并同时表现出大鼠在水迷宫行为学参数的变化，提示ＭＡＰ－２可能发挥了提高神经功能的作用。
本实验结果显示，脑缺血后大鼠的分辨学习的能力明显下降。针刺、康复训练以及针刺结合康复均能促进学习能力的恢复，但针康法疗效*佳。**组化结果 显示，与假手术组 比较，各组 大鼠的ＭＡＰ－２表达均较对照组明显，差异具有统计学意义（
Ｐ＜０．０５）。与模型组比较，受干预组表达更明显，差异具有统计学意义（Ｐ＜０．０５），且针康组效果*明显，差异具有统计学意义（Ｐ＞０．０５）。表明单纯康复训练、单纯针刺与针刺结合康复训练均能明显促进神经元树突发芽和再生，进一步促进新的突触形成，而后者作用更明显。本实验中ＭＡＰ－２蛋白表达增加的同时有脑梗死大鼠行为学的改善，并且与学习记忆功能的恢复呈正相关。表明针刺结合康复训练可明显促进脑缺血大鼠神经功能，改善学习记忆能力。进而促进其躯体运动功能恢复的效率，提高生活质量。在今后的实验中，我们争取能够对脑卒中患者的其他功能康复做更为广泛的深入研究。
