【摘要】  目的 研究创伤痛大鼠痛阈的昼夜节律变化。方法 经过痛阈筛选的96只SD大鼠随机分为12组,每组8只,其中每2组作为1个观察时间点,分别于8:00(ZT0)、12:00(ZT4)、16:00(ZT8)、20:00(ZT12)、24:00(ZT16)、4:00(ZT20)这6个时间点用甩尾法测定动物痛阈后,分别在相应的时间点对动物进行处理:空白对照组(不截肢)、截肢模型组(截肢)。截肢后立即测定动物的术后痛阈,计算截肢前后的痛阈改变率。结果 正常大鼠痛阈具有明显的昼夜节律,明期痛阈较高,暗期痛阈较低;创伤痛大鼠痛阈明显降低,尤其以早晨8点左右痛阈下降明显。结论 痛阈具有明显的昼夜节律,研究结果可为临床选择手术时机等提供实验依据。

【关键词】  时间生物学;昼夜节律;痛阈

　　疼痛是多种**的共同病理表现,过强的疼痛或长期慢性的病理性疼痛,将引起机体产生一系列的生理病理改变。大量的临床和实验研究表明,在不同的时辰,机体对疼痛的反应性的高低并不是恒定不变的。我们研究了创伤痛大鼠痛阈的昼夜节律变化,现将结果报告如下。

　　1 实验材料

　　1.1 实验动物

　　选用SD大鼠(SpragueDawley rat,Inbred strain),清洁级合格动物,体重161.63 g±24.92 g,2月龄,雌雄各半,由成都中医药大学实验动物中心提供(合格证号:川实动管质第9号)。所有动物在实验前适应性驯养10天,进行痛阈筛选,其标准是:痛阐测定在5～15 s左右能引起甩尾反应者用于实验,凡痛阈值高于15 s或低于5 s者,表示动物反应迟钝或过敏,则不纳入实验对象。本实验所有纳入实验动物的平均痛阈为8.15 s±2.58 s.　　实验在成都中医药大学时间医学测试室进行,隔音、通风、恒温(22℃±1℃)、相对湿度60%～65%、自动光暗控制。所有动物均自由饮水摄食。驯养10天后用于实验。

　　1.2 主要器械及仪器设备

　　7360型疼痛甩尾痛阈测定仪(核定电压220 V,频率50 Hz,电流1.25 A,UGO BASILE S.R.L,Biological Research Apparatus,意大利)。

　　2 实验方法

　　2.1 动物分组及处理

　　2.1.1 动物分组

　　实验开始前,将经过痛阈筛选符合实验标准的96只大鼠分别称重后,将痛阈和体重作为双重选择指标,利用SPSS 12.0软件,将动物随机分为12组,每组8只,雌雄各半。其中每2组作为1个观察时间点,分别于6个相应的时间点对不同组的动物进行相应处理。所有动物提供8 am8 pm的人工光照,时间点分别为8am(ZT0,ZT即 zeitgeber time,为授时因子时间),12am(ZT4),4pm(ZT8),8pm(ZT12),12pm(ZT16),4am(ZT20)。

　　每次实验时注意控制声、光等因素的干扰。动物适应性驯养10天后,于实验开始的**天8～12点内测定所有动物的痛阈作为基础痛阈;**天在以上6个时间点分别对每16只大鼠进行痛阈测定,测得值作为相应时间点的术前痛阈;第三天进行动物处理,每个时间点的4个组的动物的手术及痛阈测定(术后痛阈)均同时开始进行。

　　2.1.2 动物处理

　　每个时间点的2组动物分别作以下处理。每个时间点的动物在同一时间点同时开始进行处理。空白对照组(简称空白组):不造模,于实验开始后与其他各组用同样的方法、同样的时间捆绑固定。动物总的固定时间为30 min.固定结束后立即测定痛阈。截肢模型组(简称截肢组):将大鼠固定于自制固定器上,固定10 min后行截肢手术,手术结束后继续固定动物,至总固定时间满30 min.固定结束后立即测定痛阈,测定痛阈完毕将动物放回笼内精心饲养。

　　2.1.3 造模方法

　　参照文献的方法进行:**右后肢皮肤,在踝关节下约0.5 mm处截断右后肢,缝合皮肤。

　　2.2 痛阈测定方法

　　筛选动物时,基础痛阈测定在上午812点进行。纳入实验的动物,分别在相应的时间点1 h内进行痛阈测定。测定时均在同一室温条件下,分别在6个时间(08:00、12:00、16:00、20:00、24:00、04:00)对处理前后的动物的痛阈进行测定。测定痛阈时由固定人员测量动物甩尾反应潜伏期,所有动物均以流水编号进行痛阈测试。

　　本实验采用辐射热甩尾法测定痛阈,每个时间点测试时,所有动物按照流水号测定一次后,再按照流水号重复测定**次、第三次,保证每只动物每次测试间隔均在10 min以上。取3次测定的平均值作为*后的痛阈。

　　处理前后2次测定共得到两个痛阈值,分别称为术前痛阈和术后痛阈。以痛阈变化率作为衡量针刺抗创伤痛的效应的指标之一。痛阈变化率=(术后痛阈术前痛阈)/术后痛阈×100%.创伤痛大鼠痛阈的昼夜节律实验研究

　　2.3 统计学处理

　　统计分析采用SPSS 12.0软件进行,另外,所有数据还采用Halberg余弦法进行生物节律分析。

　　3 结果

　　3.1 截肢手术前后大鼠痛阈的总体变化情况

　　将95只纳入实验的大鼠(驯养过程中1只大鼠死亡),分别于实验前、后分6个时间点测定其在相应时间点的痛阈,计算其痛阈变化率。截肢、电针后,在相应时间立即测定大鼠痛阈,结果见表1及图1。表1 截肢手术前后不同时间点动物痛阈变化比较表2 空白对照组截肢手术前后24小时动物痛阈节律变化比较表3 截肢模型组截肢手术前后24小时动物痛阈节律变化比较　　　图1 处理前24小时周期所有大鼠不同时间点全部大鼠痛阈变化的折线图

　　3.2 空白对照组大鼠实验处理前后痛阈的昼夜节律变化情况

　　对截肢手术前后空白对照组大鼠各时间点的痛阈利用Halberg余弦软件单个余弦法程序进行余弦函数拟合,并分别计算其P值(P<0.05表示具有明显的节律性)、中值、振幅及峰相位,结果显示大鼠痛阈具有明显的昼夜节律,如表2所示。由于空白对照组的痛阈变化率没有明显变化,所以不对其作节律分析。截肢手术前24小时周期全部大鼠痛阈的极坐标图和余弦曲线见图2、图3.创伤痛大鼠痛阈的昼夜节律实验研究

　　从以上图表可以看出,空白对照组大鼠痛阈在实验前后的24小时周期中具有明显的昼夜节律,且与实验前的总体变化节律接近,均为白天痛阈高,夜间痛阈低,其中16点时*高,0点(24点)4点*低。图2 截肢手术前24小时周期全部大鼠痛阈的极坐标图和余弦曲线图　图3 空白对照组实验后24小时动物痛阈的极坐标图和余弦曲线图

　　3.3 截肢模型组大鼠截肢手术前后痛阈的昼夜节律变化情况

　　对截肢手术前后截肢模型组大鼠各时间点的痛阈利用Halberg余弦软件单个余弦法程序进行余弦函数拟合,结果见表3及图4～图6.创伤痛大鼠手术前痛阈节律与空白对照组类似。截肢模型组大鼠痛阈在实验前的24小时周期中具有明显的昼夜节律,与实验前的总体变化节律接近,均为16点时*高,0点(24点)～4点*低;实验后的痛阈和痛阈变化率均显示出一定的昼夜节律,提示创伤痛大鼠的痛阈仍然具有昼夜节律,其痛阈变化率也表现出较弱的昼夜节律(P值为0.049,与0.05接近),说明各时间点痛阈变化并不相同,出现明显的时辰差异。图4 截肢模型组截肢手术前24小时动物痛阈的极坐标图和余弦曲线图图5 截肢模型组截肢手术后24小时动物痛阈的极坐标图和余弦曲线图图6 截肢模型组截肢手术后24小时动物痛阈变化率的极坐标图和余弦曲线图

　　4 讨论

　　早在19世纪,人类就已发现疼痛反应具有昼夜节律性。大量的临床和实验研究表明,在不同的时辰,机体对疼痛的反应性的高低并不是恒定不变的。机体的痛阈具有明显的以24 h为周期的昼夜节律,如Li G等对小鼠的痛阈研究显示,夜间小鼠甩尾潜伏期更长(痛阈更高),且**受体拮抗剂纳洛酮(10 mg/kg,i.p.)可降低痛阈[2];Koch HJ等研究了13例2127岁健康受试者在 6点、12点、18点和24点4个时间点对止血带压迫所致疼痛的耐受性,研究显示,24点时对压迫性疼痛的耐受性*高[3]。而且随着疼痛、镇痛的基础和临床研究的逐渐深入,其对**功能的影响也越来越受到人们的关注。手术、创伤等对机体造成**功能的抑制已研究很多,这种疼痛及创伤等应激所造成的机体**抑制等效应,也具有明显的昼夜节律特征[4]。时间生物学研究表明,人及动物对疼痛的敏感性均存在时间节律性,而许多镇痛**及镇痛手段的镇痛效应也具有时间节律性,如**类镇痛剂夜间的镇痛效应明显优于白天[5]。我们的研究结果显示,正常大鼠痛阈具有明显的昼夜节律,其峰值在白天12点16点,谷值在夜间0点凌晨4点左右,即明期痛阈较高,暗期痛阈较低;创伤痛大鼠痛阈明显降低,尤其以早晨8点左右痛阈下降明显,这可为临床选择手术时机等提供实验依据。