众多研究和临床实践表明, 脑内DA 系统与动物的运动、学习、记忆、情绪等活动有密切关系。帕金森病 ( Park in son ’ s d isease, PD ) 就是原因不明的黑质DA 能神经元变性丢失, 导致纹状体内DA 释放量减少, 从而出现僵直、静止性震颤和运动障碍等症状, 并伴有痴呆发生。目前PD 大鼠模型大多以**诱导的旋转实验作为建模成功与否的观察指标, 但此时黑质DA 能神经元丢失80% 左右, 纹状体DA 含量下降超过 90% , 相当于临床PD 晚期。利用开野实验作为行为学观察指标, 动态观察黑质DA 能神经元形态学变化与行为改变之间的关系, 相关报道还不多见。本实验利用 6-O HDA 特异毁损大鼠单侧黑质DA 能神经元, 在不同时间点观察DA 能神经元的病理变化, 丢失比例和行为学改变, 分析两者之间的相关性, 以期为 PD 早期模型提供行为学评价指标, 为 PD 早期病理改变和神经生化研究提供指导。
1 材料与方法
1. 1 仪 器 及 主 要 试 剂 脑立体定位仪 , 微量推进器 , SuperMaze动物行为图像分析系统 , 旷场实验箱，6-O HDA 、酪氨酸羟化酶 抗体 , SABC、 DAB 。
1. 2 实验动物及分组 健康 Sp rague2 D aw ley雄性大鼠 60 只 ( 安徽医科大学实验动物中心提供) ,体重 210 ～ 240g , 随机分为正常对照组 ( N C ) ( n =10) , 实验对照组 ( EC ) ( n = 10) , 和实验组 ( n = 40) ,后者按处死时间不同随机分成 4 组, 每组 10 只。
1. 3 6-O HDA 毁 损 7% 水 合 氯 醛 ( ip ,350 m g/kg ) 麻醉大鼠, 头颅水平位固定在脑立体定位仪上, 门齿沟平面比耳间线平面低2. 4 mm , 剪去头部毛, 切开头皮, 暴露颅骨前囟点 ( 若不清晰, 可用3% H 2 O 2 擦洗) , 参照包新民等
著《大鼠脑立体定位 图 谱》确 定 右 侧 SN c 区 坐 标 前 囟 后 (A P )- 5. 2 mm , 右侧旁开 (R ) 1. 3 mm , 深度 ( V ) 8. 0 mm ,颅骨钻孔后 ( 切勿损伤软脑膜) , 1L l 微量注射器插入右侧SN c 区, 注射8g /L 6-O HDA ( 溶于0. 2% V itC 生理盐水溶液) 1L l, 利用微量推进器缓慢推进 ( 0. 5L l/m in ) 。注射完毕, 留针5 m in 后缓慢拔针, 缝合皮肤并肌注硫酸庆大霉素 ( 5 m g/kg ) 预防感染, 清醒后置笼喂养。 EC 组仅注射0. 2% V itC 生理盐水溶液1L l , N C组不手术。
1. 4 开场实验 (op en 2 f ield test )
敞口木箱60cm ×60cm ×40cm , 里面涂成黑色, 箱底划为 25 个方格 ( 12 cm ×12cm ) , 将大鼠放入正中一格, 10 s 后开始记录 15 m in 内各项行为指标。观察指标: ( 1) 旋转行为, 记录左、右侧旋转的圈数, 按公式右侧/( 左侧+ 右侧) 计算不对称指数; ( 2) 探究行为, 鼻子距离箱壁 5cm 以内的跑动时间; ( 3) 穿梭距离, 规定时间内跑动的格子数 ( 二爪以上跨入邻格为跑动一格) ;( 4) 下肢站立, 双上肢抬起离地 1cm 以上的次数; ( 5)修饰次数, 理毛、洗脸、舔舐次数。在毁损术后1d 、 3d 、5d 、 7d 、 14d 、 21d 各观察 1 次, 每次实验均在 7: 00 ～12: 00 AM 进行, 实验室内暗光、安静, 两次实验之间将箱底打扫干净。
1. 5 形态学观察
1. 5. 1 取材 分别在术后 1d 、 7d 、 14d 、 21d 行为学测试完毕, 7% 水合氯醛 ( ip , 350 m g/Kg) 麻醉大鼠, 置于冰盘上, 打开胸腔, 暴露心脏, 先用 0. 9%N aC l 100 m l 经心脏冲洗, 然后300 m l 4% 多聚甲醛灌注固定, 取出脑组织4% 多聚甲醛后固定24h。在针道旁冠状面切开, 石蜡包埋, 连续切片, 片厚 6L m , 常规H E 染色。定位不在SN c 区的大鼠从该组剔除, 不进行统计学分析。
1. 5. 2 N issl 染色 切片脱蜡至水, 0. 1% 硫堇冰醋酸水溶液染色15 ～ 20 m in, 95% 酒精快速分色 ( 2～ 3 s 即可) , 脱水、透明、封片、镜检。
1. 5. 3 **组织化学染色 ( ABC 法) 切片脱蜡至水后经 3% H 2 O 2 灭活内源性过氧化物酶, 微波抗原修复 2 次, 正常山羊血清封闭 20 m in 后, 1 ∶500TH 一抗 4℃冰箱孵育过夜, 滴加生物素化二抗和 SABC 37℃各孵育 20 m in。其间, 各步骤间均用0. 01 mo l/L PBS (pH 7. 2) 充分洗涤, *后加DAB 显色 ( 镜检控制显色时间) , 常规脱水、透明、封片、镜
检。
1. 5. 4 电镜观察 灌注固定后, 分离黑质和纹状体约 1 mm
3, 2. 5% 戊二醛、 1% 锇酸双重固定, 脱水, Epon 812 包埋, L KB- NOVA 切片机超薄切片,醋酸铀枸橼酸铅双重染色, 透射电镜观察。
1. 5. 5 图像分析 采用江苏捷达图像分析系统对切片进行图像分析, 根据N issl 染色圈出黑质范围, 采用同一放大倍数 ( ×100) , 同一光强度下测量阳性数密度, 并按照公式: 100- ( 右侧细胞数/ 左侧细胞数) ×100, 计算DA 能神经元毁损程度。
1. 5. 6 统计方法 所有数据采用X ±s 表示,SPSS11. 5 统计软件进行分析, 采用单因素方差分析( ANOVA ) 进行组间比较, *小有意义差异 t 检验( L SD -t) 进行组内两两比较, 开野实验各参数与黑质DA 能神经元毁损比例作 Pear son’ s 相关分析。
2 结 果
2. 1 开场实验结果 ( 1) 旋转行为: 组间比较差异有显著性 (P < 0. 05) 。在术后 1d 右侧旋转行为增多 ( 与对照组比较P < 0. 05) , 3d 、 5d 恢复到对照组水平 ( P > 0. 05, 与 1d 、 14d 、 21d 组比较 P <0. 05 ) , 而后右侧旋转又逐渐占据优势 ( 14d 、 21d 组与对照组比较 P < 0. 05) ; ( 2) 探究行为: 组间比较差异有显著性 (P < 0. 01) 。术后 1d 较对照组大幅减少( P < 0. 01 ) , 3d 、 5d 接近对照组水平 ( P > 0. 05, 与1d 、 7d 、 14d 、 21d 组比较 P < 0. 01 ) , 此后逐渐降至较低水平 ( 与对照组比较 P < 0. 01) ; ( 3) 穿梭距离: 组间比较差异有显著性 ( P < 0. 01) 。实验组变化趋势呈正态分布, 1d 、 14d 、 21d 组与5d 组及对照组比较差异有显著性 (P < 0. 01) , 5d 组与对照组比较差异无显著性 ( P > 0. 05 ) ; ( 4) 下肢站立: 组间比较差异有显著性 (P < 0. 01) 。各实验组与对照组比较差异均有显著性 (P < 0. 01) , 3d 、 5d 组也有恢复倾向 ( 与 1d 、21d 组比较 P < 0. 05 ) , 但与对照组相比仍处于较低水平; ( 5) 修饰行为: 变化没有规律性, 组间比较差异
无显著性 (P > 0. 05) 。
2. 2 形态学观察结果 ( 1) H E 染色和N issl 染色显示, 从 1d ～ 21d 大鼠 6-2 O HDA 注射侧SN c 区神经元较对侧明显减少, 尼氏体着色较对侧淡, 针道及毁损区可见不同程度胶质细胞浸润, 对照组左右侧细胞数均无明显变化。( 2) **组化染色显示 , TH 阳性神经元随时间推移逐渐减少, 毁损比例不断增大, 没有恢复倾向, 对照组无明显变化。( 3) 电镜结果从1 ～ 21d 大鼠黑质神经元超微结构损伤逐渐加重, 线粒体肿胀、嵴
消失, 粗面内质网和高尔基体也有肿胀; 21d 神经元水肿, 游离核糖体减少, 溶酶体增多; 在纹状体则有髓鞘松解断裂, 突触小泡多为清亮型, 颗粒小泡极少甚至看不见。
2. 3 相关分析结果 旋转行为与黑质DA 能神经元毁损比例呈正相关 ( r = 0. 471, P < 0. 01) ; 探究行为、穿梭距离、下肢站立行为均与毁损比例呈负相关 ( r = - 0. 719 、 - 0. 594 、 - 0. 589, P < 0. 01 ) ; 修饰行为与毁损比例无相关性( r= - 0. 227, P > 0. 05) 。
3 讨 论
DA 作为内源性神经递质作用于基底核 ( basalgang lia) 的 D 1 、 D 2 受体, 平衡调节基底核为中心的直接和间接神经回路功能。基底核并不发布对肌肉收缩的命令, 而是通过选择不同的神经元发放电活动,参与随意运动的程序编制和运动程序的执行, 在调节运动的组成、方向、顺序、速度和幅度等方面发挥其作用。 PD 由于 SN c 区DA 能神经元退变, 导致纹状体DA 含量下降, DA 对间接回路的去抑制和对直接回路的兴奋两种功能严重丧失, 导致运动障碍。本实验的结果也显示, 实验组大鼠在毁损术后 1d 即有明显行为学改变, 其中旋转、探究、后肢站立和穿梭行为与黑质 DA 能神经元丢失比例有很好的相关性,而正常对照组和实验对照组大鼠的行为在实验前后没有明显改变。脑内DA 神经系统具有一定的代偿功能, 如 PD患者在出现临床症状时 SN c 区DA 能神经元丢失已达80% 以上, PD 模型大鼠由于 DA 受体超敏出现 DA激动剂诱导的旋转运动等。在我们的行为学实验中也观察到这种代偿现象, 开野实验的旋转、探究、后肢站立和穿梭行为指标在术后 3d 、 5d 有趋于改善的
倾向, 其可能机制: ( 1) DA 更新率增加, 残存的DA 能神经元合成和释放DA 的能力增强; ( 2)DA 受体超敏, 包括受体敏感性增强和受体数目的增加;( 3) 信号转导效率的增强, 如 Gs 蛋白上调, A C 酶活力提高, 细胞外信号调节蛋白激酶 ( ex tracellu larsignal2regu lated k inase, ER K ) 的活化等。我们的实验未发现修饰行为与黑质毁损比例有相关性, 但Ber r idge大鼠旷场实验与黑质多巴胺能神经元的相关性研究
指出纹状体在修饰行为的整合中起重要作用, 如果毁损双侧纹状体前外侧部, 则将打破修饰行为链。因此, 我们认为毁损一侧SN c 区只能导致一侧纹状体 DA 含量下降, 而健侧纹状体足以发挥代偿作用, 保持修饰行为链的完整性。另外, 可能与环境变化、手术损伤、麻醉等外界因素和观察时间不够也有一定的关系。6-O HDA 即 2. 4. 52 三羟基苯乙胺, 是一种选择性儿茶酚胺能神经元化学毁损剂, 单独或联合注射到大鼠 SN c 、内侧前脑束 ( M FB ) 、纹状体 (Cp u ) 、腹侧被盖区 ( V TA ) 等不同脑区, 选择性地毁损DA 和N E能神经元 ( 尤其对前者作用更显著) 制作不同程度损害的PD 模型。其作用机制是: 6-O HDA 通过多巴胺转运体进入 DA 能神经元, 快速氧化生成氧自由基( O 2-和·O H ) , 抑制线粒体氧化呼吸链复合物É , 并激活 casp ase 启动细胞凋亡, 从而导致黑质DA 能神经元丢失。在我们的实验中, 6-O HDA SN c 区注射后24h 即有50% 以上的DA 能神经元丢失, 而后随时间推移毁损比例不断增大。**组化切片经N issl复染发现, 非 DA 能神经元形态完整, 数量并不减少,在早期甚至有增多现象, 这说明 6-O HDA 是一种实用可靠的特异性 DA 能神经毒剂。但该法制作的模型仍属于急性损伤完全毁损模型, DA 神经元在注药后4h 即可见丢失。若用**诱导旋转实验作为鉴定标准, 一般为术后 2 ～ 3 周阳性, DA 神经系统毁损已相当严重, 不利于观察轻中度毁损模型。许多研究指出, 对轻中度毁损模型的研究更有助于对临床 PD 早期患者病理形态、神经生化和轻度行为异常的了解,有 助于 PD 病因、发病机制和**、细胞移植及基因**的研究。因此, 建立一个敏感反映轻中度毁损的行为学观测指标, 具有较大的现实意义。我们利用开野实验对毁损早期的大鼠进行行为学的观察, 发现术后 1d 各项指标即已发生明显改变, 并能很好地动态反映 DA 毁损程度。开野实验不仅适用于轻中度毁损模型的观测, 还能反映毁损早期机体的代偿情况,并且各参数间可相互佐证, *大程度地减少主观因素的影响。因此, 我们认为开野实验是一个很好的反映DA 神经系统毁损程度的行为学观察指标。大鼠旷场实验与黑质多巴胺能神经元的相关性研究。
