【摘要】 目的观察β-淀粉样蛋白1-40（Aβ1-40）大鼠海马双侧注射后大脑组织Caspase-3表达和海马神经细胞超微结构的变化及加减地黄饮子的干预作用。方法采用大鼠海马立体定向注射凝聚态Aβ1-40诱导阿尔茨海默病（AD）动物模型。采用**印迹方法检测大脑组织Caspase-3的表达，通过透射电子显微镜观察海马组织神经细胞超微结构的变化。结果模型组大鼠大脑组织Caspase-3蛋白表达相对值（2.647±0.603 6）较假手术组（0.901±0.102）明显升高（P＜0.05），而加减地黄饮子(1.331±0.105 3)可下调Caspase-3的表达（P＜0.05）。Aβ1-40可致模型组大鼠海马神经元的胞体质膜下出现大量的脂褐素，游离核蛋白体减少，加减地黄饮子对损伤有不同程度的恢复。结论加减地黄饮子通过上调Caspase-3蛋白的表达而发挥保护Aβ对大鼠脑神经细胞的损伤。
【关键词】 阿尔茨海默病；加减地黄饮子；Caspase-3
【Abstract】 Objective To observe the effects of modified decoction of Rehmanniae on expression of caspase-3 protein and ultrastructural changes of pyramidal neurons in hippocampal in Alzheimer′s disease (AD) rats induced by amyloid-β1-40 injection into brain.Methods AD model rats were induced by amyloid-β1-40 sterotaxis injection.Modified decoction of Rehmanniae was given by oral administration for 28 days.Expression of caspase-3 protein in rat brain was estimated by Western blotting method.Ultrastructure of pyramidal neurons in hippocampal was observed by transmission electron microscope.Results The expression of caspase-3 in model group (2.647±0.603 6) was significantly higher than that in sham group(0.901±0.102) （P＜0.05）,and that in the modified decoction of Rehmanniae group (1.331±0.105 3) was significantly lower than that in model group （P＜0.05）.Lipofuscin deposit in hippocampal neurons in model group and the cell apparatus numbers decreased.Modified decoction of Rehmanniae treatment had protective effects on the neuronal cells damnification.Conclusions Modified decoction of Rehmanniae protect brain neurons from being injuried by Aβ1-40 by up-regulating the expression of caspase-3 protein.
【Key words】 Alzheimer′s disease；Modified decoction of Rehmanniae；Caspase-3
阿尔茨海默病（AD）是一种以进行性认知障碍和记忆能力损伤为主的**神经系统退行性变性**，目前认为AD患者记忆力减退和认知功能障碍的主要相关病理现象是神经元丢失〔1〕，有研究提示，神经细胞过度凋亡是神经元丢失的主要原因，体外研究发现AD的核心成分β-淀粉样蛋白(Aβ)能诱导神经元的凋亡〔2〕。Caspase家族激活是大多数细胞凋亡的共同途径，并且其抑制剂可阻断Aβ诱导的神经元凋亡，提示Caspase在AD神经元退变中起重要作用〔3〕。为此，我们采用海马立体定向注射技术将Aβ1-40注入大鼠双侧海马诱导AD模型，并观察加减地黄饮子提取物对AD模型大鼠脑组织Caspase-3蛋白表达和海马超微结构的干预作用，揭示中药提取物对Aβ诱导的神经元凋亡的保护作用及机制。
1 材料与方法
1.1 实验** 加减地黄饮子提取物：肉苁蓉、麦冬、人参、远志、五味子和山茱萸等用8倍量70%的乙醇回流提取3次，每次2 h；生姜、薄荷和石菖蒲加10倍量水6 h提取挥发油；方中熟地、茯苓、巴戟天、石斛、大枣与醇提取后的药渣及挥发油提取后药渣一同加16倍的水，回流提取3次，每次1 h；醇提取浓缩液和水提取浓缩液混合，血竭等原粉加入，干燥得干膏，干膏粉碎成细粉，加入挥发油。实验用不含赋形剂的浸膏。盐酸多奈哌齐片由法国PFIZER PGM公司制造，产品批号5136903。Aβ1-40为北京中杉金桥生物技术有限公司产品。Aβ1-40使用前用无菌生理盐水稀释成10 μg/μl，37℃孵育1 w，使其变为聚集状态的Aβ。
1.2 实验动物 选用健康雄性清洁级SD大鼠100只，鼠龄8～12 w，体重(280±10) g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，许可证编号SCXK（京）2002-0003。经适应性饲养1 w，随机分为空白对照组、假手术组、模型组、盐酸多奈哌齐组和加减地黄饮子组共5组。
1.3 试剂蛋白提取试剂盒Ⅰ（北京天来生物医学科技有限公司）；BCA蛋白浓度测定试剂盒（北京赛驰生物科技有限公司）；辣根酶标记山羊抗兔IgG（H+L）（美国Jackson Immunoresearch Laboratories公司）；Caspase-3（H-277）(德国Santa Cruz公司) ；Western blotting luminol reagent（德国Santa Cruz公司）；蓝色预染低分子量蛋白质Marker（14.4～97.4 kD）（Solarbio公司）；考马斯兰蛋白测定试剂盒（南京建成生物工程研究所）；其余均为分析纯试剂。
1.4 仪器 JY-ZY2型转移电泳槽、JY-CZ1型单垂直电泳槽(北京君意东方电泳设备有限公司)；江湾Ⅰ型C立体定向器（**军医大学）；EM208S透射电子显微镜（荷兰飞利浦公司）；morris水迷宫分析系统可以由亚搏APP·官方网站（中国）v2.78IOS下载/Android通用版/手机APP提供，型号：XR-XM101。
1.5 方法
1.5.1 制模〔4〕 实验大鼠经腹腔注射1%****钠（40 mg/kg）麻醉后，立体定向器耳杆固定头部。颅顶区备皮**后作2 cm切口，分离骨膜使头骨暴露。于前囟向后3.0 mm，在分别向中线左和右各旁开2.2 mm处，用牙科钻打开颅骨。垂直进微量进样器针2.8 mm，将1 μl溶液在5 min缓慢注入，并留针5 min使溶液充分弥散。模型组、盐酸多奈哌齐组、加减地黄饮子组左右侧海马各注射1 μl Aβ1-40溶液，假手术组注射1 μl生理盐水后**并缝合切口皮肤。
1.5.2 给**法 造模后3 d开始给药，根据人和动物按体表面积折算的等效剂量。盐酸多奈哌齐组按0.33 mg·kg-1·d-1，加减地黄饮子组按1.0 g·kg-1·d-1给药，1次/d灌胃。其余3组给等体积生理盐水，共4 w。
1.5.3 Western印迹检测Caspase-3蛋白表达采用蛋白提取试剂盒Ⅰ提取蛋白质。每组大鼠各取4只，Morris水迷宫测试（另文报道）完后迅速取脑，将100 mg脑组织剪碎后加入0.5 ml裂解液匀浆，加1 ml抽提试剂室温静置10 min，于4℃ 10 000 r/min离心10 min，弃去液体后室温干燥沉淀。将提取蛋白加200 μl上样缓冲液，煮沸10 min，室温放置20 min溶解沉淀，置-80℃保存备用。用BCA法检测样品蛋白质浓度后，取50 μg蛋白质加入2×SDS凝胶加样缓冲液中，置水浴煮沸5 min使蛋白质变性，然后将样品经10% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳2 h分离。胶中蛋白质在70 mA恒流状态下4℃过夜电泳转移至硝酸纤维素膜。膜在5%脱脂奶粉37℃封闭2 h。将兔抗大鼠Caspase-3（1∶500）与硝酸纤维素膜4℃培育过夜。与辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG（1∶2 000）37℃温预1 h。用Western印迹荧光发光检测试剂盒发光、压片。以上反应均在塑料袋内进行，其间用TTBS充分洗涤。Western印迹检测结果采用AlphaImagerTM 图像分析系统扫描，利用AlphaEaseFC软件测定积分光密度值。在Western印迹分析中，以空白对照组Caspase-3杂交带的积分光密度值为相对值，其他各组杂交带的积分光密度值均与空白对照组杂交带的积分光密度值比，得出相对值。以相对值来半定量分析各组的表达量，以避免不同批次杂交形成的条件差异，显色长短不一产生的误差。
1.5.4 海马锥体细胞超微结构的观察每组大鼠各取3只，Morris水迷宫测试完后立即断头处死，剪开头皮，暴露颅骨，由枕骨大孔处迅速剪开颅骨，剥离脑组织，游离海马，在含2.5%预冷的戊二醛溶液中，将海马切成1 mm厚左右的横断薄片，30 min后再次在固定液中切取小于2 mm的海马区小组织块，继续固定2 h；0.1 mol/L磷酸缓冲液冲洗后1%锇酸后固定2 h。梯度乙醇和丙酮混合液脱水至100%丙酮，在此期间同时用溶于70%乙醇的醋酸双氧铀进行块染。置于环氧树脂包埋液渗透24 h；以环氧树脂全包埋液包埋后，63℃聚合72 h；半薄切片定位海马锥体细胞层后进行修快，超薄切片，枸橼酸铅和双氧铀染色后上透射电子显微镜观察并拍照。
1.6 统计学方法计量资料以x±s表示，运用SPSS13.0软件，组间差异采用单因素方差分析,进一步post-hoc分析采用SNK检验。
2 结果
中药提取物对阿尔茨海默病模型大鼠神经细胞凋亡的干预
2.1 加减地黄饮子对AD大鼠海马锥体细胞超微结构的影响电镜下，模型组和假手术组大鼠海马锥体细胞超微结构基本正常，模型组大鼠海马神经元的胞体质膜下出现大量的脂褐素，游离核蛋白体减少。盐酸多奈哌齐组和加减地黄饮子组胞质内脂褐素和尼氏体较多。突触小泡数量明显增多，锥体细胞的损伤有不同程度的恢复（图1）。
2.2 加减地黄饮子对AD大鼠脑组织Caspase-3蛋白表达的影响模型组海马组织匀浆中Caspase-3表达相对值（2.646±0.604）较假手术组（0.901±0.102）明显升高（P＜0.05）。加减地黄饮子组海马匀浆中Caspase-3表达相对值（1.331±0.105）较模型组降低（P＜0.05），加减地黄饮子组海马匀浆中Caspase-3表达相对值较盐酸多奈哌齐组（1.804±0.280）低（P＜0.05）（图2）。
图1 海马神经细胞超微结构改变（略）
图2 大鼠脑组织Caspase-3蛋白表达（略）
3 讨论
AD主要病理特征有老年斑、神经元纤维缠结和神经元丢失，细胞凋亡是AD神经细胞死亡的一条重要途径〔5〕。Aβ对神经元存在直接毒性作用，在体内体外均可引起神经细胞凋亡，它的异常代谢被认为是AD各种病理改变的共同通路。目前，抗神经细胞凋亡已成为**AD的靶点之一。细胞凋亡是一系列蛋白酶活化后产生的级联反应，Caspases是一类调节凋亡的半胱氨酸蛋白水解酶，活化后是凋亡过程中水解特异性底物的关键效应器〔6〕。虽然在细胞凋亡中存在着不同的死亡信号转导途径，Caspase-3则可能是细胞凋亡下游的关键执行者，它的激活是刺激特异性反应导致神经元丢失的重要机制〔7〕。
目前化学****AD收效颇微，相形之下，中药多组分、多靶点和协同作用的特点使其更适合防治AD。地黄饮子原方出自刘完素《黄帝素问宣明论方》，用于**喑痱证。结合诸多医家临床应用体会，我们提出**化痰**开窍法并将古方地黄饮子予以化裁用于AD的**，并在临床上取得了一定疗效。研究发现，加减地黄饮子能改善AD大鼠学习记忆能力〔4〕，本实验通过立体定向海马部位注射Aβ1-40的方法，诱导AD大鼠模型，以加减地黄饮子进行**干预，从凋亡相关基因Caspase-3 蛋白表达和海马锥体细胞超微结构改变方面观察了其对Aβ诱导的实验性AD模型大鼠的影响。结果显示，模型组脑组织Caspase-3表达相对值较假手术组升高，加减地黄饮子组脑组织Caspase-3表达相对值较模型组降低（P＜0.05）；加减地黄饮子组脑组织Caspase-3表达相对值较盐酸多奈哌齐组降低（P＜0.05）。表明Aβ1-40海马注射促进Caspase-3蛋白表达，而加减地黄饮子对其表达则有抑制作用。通过超微结构的观察也发现加减地黄饮子对锥体细胞的损伤有不同程度的恢复作用。表明加减地黄饮子抑制Aβ诱导的细胞凋亡，从而减少了神经元的丢失，对AD发挥**作用。中药提取物对阿尔茨海默病模型大鼠神经细胞凋亡的干预
