大鼠脑创伤后p53、Bax和Fas蛋白的表达与神经细胞凋亡对学习记忆功能影响的实验研究
摘 要
目的：在分子生物学水平，进一步深入研究颅脑创伤后神经细胞延迟性死亡的机制，探讨美洛宁对大鼠脑创伤后学习记忆功能的影响，为临床**颅脑创伤病人提供一定的理论基础。大鼠脑创伤后对学习记忆功能影响的实验研究
材料与方法：1、采用Marmarou 1994年创立的方法建立大鼠重型闭合性颅脑创伤模型。2、将Wistar大鼠300只随机分为脑创伤组（96只）、美洛宁**组（96只）、假手术组（96只），每组又分别划分成伤后3小时、6小时、12小时、24小时、48小时、72小时、168小时及336小时等8个时相组，另取12只作为正常对照组。3、给**法：美洛宁**组经致伤后，给予腹腔注射美洛宁（30mg/kg/天），直至各时相点处死；脑创伤组、假手术组及正常对照组在相同时间给予等量的生理盐水腹腔注射作为对照。4、另取48只大鼠随机分为脑创伤组（12只）、美洛宁**组（12只）、假手术组（12只）及正常对照组（12只），进行水迷宫测试。5、采用HE染色、**组织化学、原位细胞凋亡检测及Morris水迷宫等方法，动态观察大鼠颅脑创伤后海马区的组织病理改变，p53、Bax和Fas蛋白的表达情况以及空间学习记忆的改变。6、通过比较伤后各组相同时相点海马区神经细胞凋亡、p53、Bax和Fas蛋白表达以及学习记忆功能的变化特征，探讨美洛宁对大鼠伤后学习记忆功能障碍的影响。
结果：1、重型闭合性颅脑创伤后海马CA2-3区于伤后72小时可观察到广泛的神经元变性、坏死。，随后该病理趋势逐渐减缓。2、凋亡阳性细胞在伤后24小时开始出现，随时间延长数量逐渐增多，伤后7天达高峰随后数量开始下降。凋亡阳性细胞主要位于海马CA2-3区及齿状回。假手术组各时相点及正常对照组海马CA2-3区未检测出凋亡阳性细胞。3、大鼠伤后3小时海马CA2-3区出现P53蛋白表达。12小时明显增强，1-2天达高峰，3天即有所下降，于伤后7天已不能检测到p53蛋白的**反应，镜下观察可见阳性细胞着棕黄色。。假手术组各时相点及正常对照组海马CA2-3区未检测出p53蛋白表达阳性细胞。4、大鼠伤后6小时海马CA2-3区Bax蛋白的**反应增强，于2-3天达高峰，伤后7天明显下降，于14天恢复至正常水平。正常对照组CA2-3区可见轻度的Bax蛋白的**反应，假手术组各时相点均与正常对照组无明显差异。5、大鼠伤后6小时海马CA2-3区出现Fas蛋白的表达增加，于12小时明显增强，2-3天达高峰，7天明显下降，于14天Fas蛋白**反应消失。假手术组各时相点及正常对照组海马CA2-3区未检测到Fas蛋白的表达。6、美洛宁**组伤后海马神经细胞P53、Bax及Fas蛋白表达高峰均较创伤组明显下调。凋亡阳性细胞密度亦较创伤组有所下调。7、Morris水迷宫测试表明，伤后大鼠存在明显的空间学习记忆障碍，于伤后9天及10天潜伏期明显延长，搜索运动轨迹显示：美洛宁**组、正常对照组及假手术组大鼠随时间在搜索策略的改变上较脑创伤组更为理想。大鼠脑创伤后对学习记忆功能影响的实验研究
结论：1、重型闭合性颅脑创伤后，海马区神经元存在有延迟性细胞死亡现象其形式不仅表现有坏死，也表现有细胞的凋亡。2、海马区神经细胞的延迟性死亡是造成大鼠伤后长期学习记忆功能障碍的主要因素之一。3、p53、Bax及Fas蛋白的表达上调可能参与调控了细胞凋亡的过程。4、美洛宁可能通过抑制p53蛋白、Fas蛋白及Bax蛋白的表达，从而抑制神经细胞凋亡。5、美洛宁可能通过抑制神经细胞坏死凋亡、促进细胞修复及重塑信息环路对伤后学习记忆功能障碍发挥**作用。
关键词：重型闭合性颅脑损伤 海马 神经元 凋亡 p53 Bax Fas 学习 记忆 Morris水迷宫 美洛宁
Experimental Research on the Effect of the Expression of p53, Bax and Fas Proteins and Neuronal Apoptosis on Cognitive function after Traumatic Brain Injury in Rats。
Abstract
Objective: On the level of molecular biology, certain theoretical bases are provided for clinical therapy on the basis of deeply studying mechanism of delayed neuronal death after traumatic brain injury and probing into the influences of cognitive functions of CTP on rats after brain trauma.
Materials and Methods: 1. The model of severe closed traumatic brain injury(TBI) was established according to the method created by Marmarou in 1994. 2. 300 Wistar rats were divided randomly into TBI group (n=96), CTP treating group (n=96) and fake operation group (n=96) and each of these three groups was divided into 8 subgroups, namely, 3, 6, 12, 24, 48, 72, 168 and 336 hours. At the same time, the rest 12 rats were taked as the normal group for comparison. 3. Medication: The CTP treating group after injury were treated with CTP (30mg/kg/d) in peritoneum; TBI group, the fake operation group and the normal group were treated with Saline for comparison at the same time and all were killed at each time point. 4. Another 48 rats were divided randomly into 4 groups, namely, brain injury group, CTP treating group, fake operation group and the normal group, and their cognitive dysfuction was evaluated using the Morris water maze(MWM)5. Adopt such methods as H&E, immunohistochemistry, TUNEL stain and Morris water maze dynamically observe pathological changes in hippocampus of rats and the expressions of p53, Bax and Fas proteins and space learning and memorizing changes after brain injury. 6. Through comparing neuronal apoptosis in hippocampus of each group at the same time point after injury, the expressions of p53, Bax and Fas proteins and the change characteristics of learning and memorizing functions, the influences of CTP on learning and memorizing obstructions of rats after injury are probed into.
Results: 1. At 72 hours postinjury, the comprehensive neuronal degeneration and necrosis could be observed in the CA2-3 region of hippocampus. ,which tend to slow down as time went on.
2. Apoptosis-positive cells began to occur at 24 hours postinjury and its number increased with the time went on and in 7days postinjury the number came to the maximum and then it began to decline. Apoptosis-positive cells lied mainly in the CA2-3 region and dentate gyrus of hippocampus. In the CA2-3 region of hippocampus, apoptosis-positive cells were not detected in the fake operation group at every time point and the normal group .
3. P53 protein expression appeared in the CA2-3 region of hippocampus in rats at 3 hours postinjury, strengthened obviously 12 hours later, reached maximum after a day or two, and declined 3 days later. After 7 days, the immune reaction of p53 proteins could not be detected, and positive cells were brown-yellow under microscope. In the CA2-3 region of hippocampus, positive cells were not detected in the fake operation group at every time point and in the normal group.
4. Immune reaction of Bax proteins strengthened in the region of CA2-3 in hippocampus in rats at 6 hours postinjury, reached maximum after 2 days or three, declined obviously 7 days later, and restored to the normal level on the 14th day. Slight immune reactions of Bax proteins could be observed in the Ca2-3 region of hippocampus of the normal group, while no obvious difference existed between the fake operation group at every time point and the normal group.
5. Fas protein expression strengthened in the CA2-3 region of hippocampus in rats at 6 hours postinjury, which became obvious 12 hours later, reached maximum after two days or three, and declined obviously 7 days later. Immune reactions of Fas proteins disappeared on the 14th day. Fas protein expression could not be detected in the C2-3 region of hippocampus in the fake operation group at every time point and in the normal group.
6. In comparison with TBI group, the apex of the expressions of P53, Bax and Fas proteins of neurons in hippocampus of CTP treating group declined obviously and apoptosis-positive cells also declined.
7. Morris water maze tests showed that obvious space learning and memorizing obstruction existed in rats after injury, delitescence prolonged obviously 9 to 10 days later. Search moving tracks shows that search strategy altered more ideally with time in the normal group and fake operation group than in TBI group.
Conclusions: 1. After severe closed brain injury in rats, the phenomena of delayed cell death existed in the neurons in hippocampus, where neuronal necrosis and apoptosis happen simultaneously.
2. Delayed death of nerve cells in hippocampus is one of the main causes of permanent learning and memorizing dysfunction in rats after injury.
3. The rising expressions of p53, Bax, and Fas proteins may participate in the regulation of the course of apoptosis after TBI .
4. CTP may suppress apoptosis of nerve cells after TBI through suppressing the expressions of p53, Fas, and Bax proteins.
5. CTP plays a important role in curing learning and memorizing obstruction after injury through suppressing necrosis and apoptosis of nerve cells, stimulating cell rehabilitation, and remolding information circulation route.
Key Words: rats; severe closed traumatic brain injury; hippocampus; neuron; apoptosis; p53; Bax; Fas; cognitive; Morris water Maze; CTP
大鼠脑创伤后对学习记忆功能影响的实验研究
前 言
颅脑创伤及其后遗症一直是危害人类健康的主要因素之一。其中颅脑创伤后学习记忆障碍对人类的影响*为普遍和持久[1][2]。学习记忆是人类赖以生存所不可缺少的重要的脑功能之一，皮质是调整学习过程的重要部位，海马是记忆储存的关键结构[3]。近年来，分子生物学研究发现，海马作为脑损伤后选择易损区，伤后出现神经细胞延迟性死亡，从而出现长期学习记忆功能障碍。目前，国内外有关这一领域的研究大多局限于缺血性脑损伤，而有关脑创伤后这一领域的确切机制尚无**的报导。因此，本研究利用Marmarou重型闭合性颅脑损伤模型，采用**组织化学、原位细胞凋亡检测及国际上先进的Morris水迷宫技术对大鼠脑创伤后神经细胞凋亡以及学习记忆功能障碍的相关机制进行探讨，同时应用美洛宁进行**，以期为临床**颅脑创伤病人提供新的理论基础和**途径。
材料与方法
实验材料
主要试剂：
原位凋亡（TUNEL）试剂盒：由德国宝灵曼公司提供。
P53、Bax、Fas**组织化学检测试剂盒：由北京市中山生物技术有限公司提供。
美洛宁（购自于广东江门生物技术公司，**批号：粤卫药准字第616021号）
主要仪器设备：
TGL-16B高速离心机（上海）。
404-3型隔水式电热培养箱（江苏）。
CMIAS-真彩色医学图象分析系统（北京）。
OLYMPUS摄像显微镜（日本）。
Leica石蜡切片机（德国）。
MM-2型微量震荡仪（江苏）。
亚搏APP·官方网站（中国）v2.78IOS下载/Android通用版/手机APP研发的Xmaze动物行为分析系统可用于开展水迷宫实验。
实验动物：
健康雄性Wistar大鼠（购自北京大学医学部实验动物中心）348只，体重300g-350g。
实验方法
实验动物分组
取300只大鼠随机分成脑创伤组（96只）、假手术组（96只）及美洛宁**组（96只）。每组又分别划分为伤后3、6、12、24、48、72、168、336小时等8个时相组，其中脑创伤组、美洛宁**组、假手术组每个时相点及正常对照组各12只大鼠。
另取48只大鼠随机分为脑创伤组、美洛宁**组、假手术组及正常对照组，每组各12只。大鼠脑创伤后对学习记忆功能影响的实验研究
大鼠闭合型脑创伤模型制备
大鼠于致伤前0.5小时，经腹腔注射阿托品（30mg/kg/天）。
以乙醚吸入方式麻醉动物至疼痛刺激反应消失。
将麻醉后大鼠腹卧位固定于海绵床垫（10×10×20cm3）上，以75%酒精**术区后，沿中线矢状切开头皮约15mm，剥离骨膜，显露冠状缝及人字缝，将一不锈钢垫（直径8mm，厚2mm）固定在大鼠冠状缝与人字缝之间。
经上述准备后，大鼠头部固定于致伤架下；重450g，直径18mm的铜棒沿垂直玻璃管2m高度自由落下致伤；即刻移开大鼠以免铜棒反弹造成头部二次击伤。
致伤后，大鼠头皮伤口常规**、缝合。
假手术组仅给予麻醉及头皮切开、缝合，但不致伤。正常对照组不做任何处理。
动物给**法
美洛宁**组大鼠伤后经腹腔注射美洛宁 1ml/次/只，每24小时1次直至各时相点处死。
脑创伤组、假手术组及正常对照组在相同时间内给予等量生理盐水腹腔注射。
标本采集与制备
于上述伤后各时相点，对动物进行乙醚吸入深度麻醉。
开胸，4%多聚甲醛经心灌流固定10分钟后，断头取出脑组织，置于4%多聚甲醛后固定12-24小时（4℃）。
取出固定液中脑组织标本，常规脱水、石蜡包埋。
冠状面连续切片，厚度约10μm，经粘片剂处理过的载玻片捞片，置于60℃烤箱烘烤1小时后，按下述方法进行染色。
HE染色方法
2.5.1 选取脑组织石蜡切片，经二甲苯及100%、95%、80%、70%浓度酒精梯度脱蜡至水，用蒸馏水冲去残存酒精成分。
2.5.2 明矾苏木素染色8分钟，自来水漂洗，去浮色（10秒钟左右），以1%盐酸酒精分色数秒，自来水漂洗半小时。
经1%氨水溶液数秒后，自来水漂洗1次（10秒钟左右）。
0.5%伊红溶液进行复染3分钟，经漂洗去除伊红浮色。
经70%、80%、95%酒精梯度脱水后，转入无水酒精脱水6分钟，二甲苯透明5分钟，中性树胶封片。
原位细胞凋亡检测（TUNEL）法
石蜡切片常规脱蜡至水。
切片滴加0.1%TritonX-100于4℃孵育5分钟,PBS缓冲液洗5分钟×3次。
每张切片滴加TUNEL标记反应混合液50μL。置于湿盒中，37℃孵育1小时。
PBS缓冲液洗5分钟×3次。擦干组织切片后，每张切片滴加AP-转化液50μL，置于湿盒中，37℃孵育30分钟。
PBS缓冲液洗5分钟×3次。
每张切片滴加BCIP/NBT显色液20μL，室温避光显10-30分钟，光镜下观察。
镜下显色满意后，PBS缓冲液洗2-3次终止显色反应。
经梯度酒精脱水、二甲苯透明后，中性树胶封片。
镜下观察，凋亡阳性细胞的染色质为新月型或蚕豆状浓染。
p53蛋白、Fas蛋白及Bax蛋白**组化检测方法
石蜡切片，常规脱腊至水。
3%过氧化氢溶液室温下孵育10分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性。
蒸馏水冲洗，PBS浸泡5分钟。
抗原修复15分钟（温度为92-98℃，修复液为柠檬酸-柠檬酸盐缓冲液，PH为6.0）。
PBS冲洗，3分钟×3次。
滴加封闭用正常血清工作液50μL，室温孵育10-15分钟，倾去，勿洗。
滴加一抗（稀释度：p53为1:50，Bax及Fas均为1:100）工作液50μL/张，37℃孵育1-2小时或4℃过夜。
PBS冲洗，3分钟×3次。
滴加生物素化二抗工作液50μL/张，37℃孵育5-10分钟。
PBS冲洗，3分钟×3次。
滴加辣根酶标记链酶卵白素工作液50μL/张，37℃孵育15-20分钟。
PBS冲洗，3分钟×3次。
DAB显色剂显色15-20分钟。
镜下显色满意后，自来水充分冲洗，经梯度酒精脱水、二甲苯透明后，中性树胶封片。
图象分析
采用CMIAS-真彩色医学图象分析系统（由北京航空航天大学提供）和OLYMPUS摄像显微镜进行海马区阳性细胞记数（个/400倍视野）及阳性细胞的平均光密度值（OD）的测定。
2.11 Morris水迷宫测试
2.11.1 Morris水迷宫实验是目前国内外研究中广泛应用的检测空间学习记忆功能***、客观的一种方法。正常对照组、假手术组、脑创伤组及美洛宁**组大鼠分别于伤后7、8、9、10天进行水迷宫测试。
实验时，将**岛随机置于水迷宫四个象限（N、S、E、W）中的任一象限，加水（奶粉冲呈乳白色）至高过**岛10mm，水温保持在22℃-25℃，由摄象机及计算机自动跟踪、拍摄和统计大鼠分别由其他三个象限入水后寻找到**岛的轨迹和潜伏值。如在180秒内未找到**岛，则潜伏期值记为180秒。
统计学方法
实验中所得数据均用X±S表示，经access数据库整理后应用美国SAS统计软件6.12 TS 020 for windows，进行t检验或方差分析。以单侧P≤0.05为差异在统计学上有显著性意义，P≤0.01为差异在统计学上有非常显著性意义。大鼠脑创伤后对学习记忆功能影响的实验研究
结 果
1 闭合型颅脑创伤模型的复制
按照Marmarou方法建立模型[4]。本实验中，大鼠致伤后多数出现有短暂呼吸停止，给予人工辅助呼吸后，自主呼吸多于30-40秒内恢复（自主呼吸未恢复者，死亡）；伤后大鼠多表现有四肢剧烈抽搐，持续时间约15-30秒，随后前肢呈去皮层屈曲状态；大鼠伤后均呈昏迷状态，多于10-20分钟内意识状态恢复并复正。上述观察结果与Marmarou所描述的模型伤后表现大致相符，说明我们复制的模型是成功的。
伤后海马区HE染色组织病理结果：
伤后24小时，脑创伤组大鼠海马区及齿状回即出现散在变性坏死神经元，镜下可见神经细胞胞体收缩，色粉红，核皱缩浓染，细胞周围出现空隙；伤后72小时，海马CA2-3区可观察到广泛水肿及神经元变性坏死改变，视野内可见有核溶解及神经元细胞空泡样变，神经元存活数目明显减少，细胞间隙显著增宽；伤后7及第14天，海马CA1-4区上述病理趋势有所缓解。美洛宁**组于伤后72小时海马CA2-3区组织病理改变较创伤组有明显改善（见Fig.1-2）。
伤后皮层和海马区P53、Bax、Fas蛋白表达检测结果：
大鼠伤后3小时海马CA2-3区出现P53蛋白表达。12小时明显增强，1-2天达高峰，3天即有所下降，于伤后7天已不能检测到p53蛋白的**反应，镜下观察可见阳性细胞着棕黄色。于伤后1-2天美洛宁**组较创伤组p53蛋白的**反应明显减轻（见Table 1、Fig.3-9）。假手术组各时相点及正常对照组海马CA2-3区未检测出表达阳性细胞。
Table 1：脑创伤组及美洛宁**组伤后海马CA2-3区神经细胞p53蛋白表达改变（OD值）
分 组 时 相 n
6h 12h 24h 48h 72h
创伤组 0.058±0.013 0.107±0.014 0.149±0.016 0.115±0.017 0.053±0.012 12
**组 0.052±0.011 0.083±0.016* 0.106±0.017** 0.085±0.018* 0.039±0.011* 12
* P﹤0.05 ** P﹤0.01
大鼠伤后6小时海马CA2-3区Bax蛋白的**反应增强，2-3天达高峰，伤后7天明显下降，于14天恢复至正常水平。于伤后2-3天美洛宁**组较创伤组的Bax蛋白的**反应明显减轻（见Table 2、Fig.10-17）。正常对照组CA2-3区可见轻度的Bax蛋白**反应，假手术组各时相点均与正常对照组无明显差异。大鼠脑创伤后对学习记忆功能影响的实验研究
Table 2：脑创伤组及美洛宁**组伤后海马CA2-3区神经细胞Bax蛋白表达改变（OD值）
分 组 时 相 n
6h 12h 24h 48h 72h
创伤组 0.067±0.009 0.082±0.011 0.101±0.018 0.140±0.015 0.147±0.019 12
**组 0.052±0.008 0.068±0.012* 0.078±0.017* 0.111±0.018* 0.104±0.015** 12
* P﹤0.05 ** P﹤0.01 正常组的OD值为0.038±0.008
3.3 大鼠伤后6小时海马CA2-3区出现Fas蛋白的表达增加，12小时明显增强，2-3天达高峰，7天明显下降，于伤后14天Fas蛋白**反应消失。伤后2-3天美洛宁**组较创伤组Fas蛋白的**反应明显减轻见(Table 3、Fig.18-24)。假手术组各时相点及正常对照组海马CA2-3区未检测到Fas蛋白的表达。
Table 3：脑创伤组及美洛宁**组伤后海马CA2-3区神经细胞Fas蛋白表达改变（OD值）
分 组 时 相 n
6h 12h 24h 48h 72h
创伤组 0.127±0.015 0.171±0.025 0.232±0.028 0.255±0.023 0.247±0.025 12
**组 0.123±0.016 0.157±0.020 0.189±0.025* 0.179±0.025** 0.174±0.021** 12
* P﹤0.05 ** P﹤0.01
伤后海马区神经细胞凋亡检测结果：
正常对照组及假手术组海马未见凋亡阳性细胞。脑创伤组大鼠伤后24小时，海马CA2-3区即出现少量凋亡阳性细胞，镜下阳性细胞核着蓝紫色；伤后72小时阳性细胞数量逐渐增多；于伤后7天达高峰；伤后14天凋亡阳性细胞数量有所下降。与美洛宁**组同时相点比较，伤后7天及14天差异性显著（见Table 4、Fig.25-31 ）。
Table 4：脑创伤组及美洛宁**组伤后海马CA2-3区神经细凋亡改变动态观察
分 组 时 相 n
24h 48h 72h 168h 336h
创伤组 18.00±3.408 21.18±3.750 24.45±3.067 29.18±4.67 15.26±3.350 12
**组 17.45±3.504 19.45±3.11 21.19±3.562* 21.00±4.64** 11.82±2.560* 12
单位：个/400倍视野 * P﹤0.05 ** P﹤0.01
Morris水迷宫测试结果：
为避免大鼠颅脑创伤后运动功能障碍对水迷宫测试结果的影响，各组分别于伤后7、8、9及第10天进行Morris水迷宫测试。结果表明，创伤组伤后第9天（P<0.01）及第10天（P<0.01）搜索**岛潜伏期较正常组及假手术组明显延长。美洛宁**组伤后第9天（P<0.01）及第10天（P<0.01）搜索**岛潜伏期较创伤组明显缩短（见Table 5、Fig.32-35）。
Table 5：脑创伤后各组Morris水迷宫测试潜伏期（单位：秒）
分 组 时 相 n
7天 8天 9天 10天
正常组 140.25±22.54 96.50±18.92 42.66±11.15 28.83±8.92 12
假手术组 144.25±16.13 96.91±22.05 41.15±12.23 28.67±9.45 12
创伤组 168.08±25.16* 128.5±27.17* 79.08±19.51** 57.06±19.08** 12
**组 150.58±21.46+ 99.41±21.04+ 50.83±15.69++ 30.25±9.28++ 12
* P<0.05vs正常组 ** P<0.01vs正常组
+ P<0.05vs创伤组 ++ P<0.01vs创伤组
讨 论 大鼠脑创伤后对学习记忆功能影响的实验研究
学习和记忆障碍是各种颅脑损伤病人伤后*为常见的脑功能障碍之一，病人主要表现为伤后短期的学习能力下降，长期的语言、视觉、辨认记忆功能障碍和记忆存储障碍[5]。目前，临床对该症尚缺乏有效的**手段。近年来，海马作为学习记忆的重要结构及脑损伤后的选择性易损区得到国内外学者的广泛关注。研究发现：（1）海马区是学习记忆形成环路中重要的功能解剖结构；（2）海马信息通路主要由齿状回、完整的海马CA1-3区、大脑脚联合及内嗅区皮层组成；（3）信息通路中的信号由内嗅区皮层向齿状回门区、海马CA3、CA1区及大脑脚联合单向传导，*后再由大脑脚联合投射至内嗅区皮层的特定部位完成整个环路[6]。以往在这方面的实验研究多限于缺血性脑损伤模型，而有关其在颅脑创伤后学习记忆功能障碍中所起的作用尚无详尽的报导。近年来，人们成功的创立了多种类型的颅脑创伤动物模型，从而为广泛开展这一领域的研究奠定了基础。诸多实验证实，闭合性颅脑创伤动物模型可成功复制出与人类脑创伤后学习记忆功能障碍相一致的临床特征，并具有简单易行、稳定性及重复性好等特点[7][8]。因此，本研究采用Marmarou等人创立的重型颅脑创伤模型，从分子生物学角度初步探讨了创伤条件下海马区病理改变的有关机制及其对学习记忆功能的影响。
一、颅脑创伤后海马区神经细胞凋亡与学习记忆功能障碍
细胞凋亡是有核细胞在一定条件下通过启动其自身内部机制，主要是通过内源性DNA内切酶的激活而发生的自然死亡过程。目前认为细胞凋亡不仅在神经系统的发育及可塑性发挥重要作用，而且还与成熟神经系统的病理状态，如：脑缺血及低血糖等密切相关。Grant Sinson等[9]在液压脑创伤模型中研究发现：脑创伤后24小时，皮层、海马及隔区即可出现凋亡的神经细胞。本研究应用TUNEL法对大鼠重型闭合性颅脑损伤模型进行凋亡细胞检测，结果显示，伤后海马区存在着神经细胞凋亡现象，凋亡阳性细胞于伤后24小时出现，7天达高峰，伤后14天明显下降。同时，HE染色发现伤后72小时存在着广泛的神经元的变性坏死。这表明脑创伤后存在着神经细胞延迟性死亡，不仅表现为坏死，也表现为凋亡。
Bonfoco 等[10]在体外皮层神经细胞的研究中发现，加入低浓度外源性NMDA可导致神经细胞出现凋亡的形态学病理改变，而高浓度则导致细胞坏死的发生，提示兴奋性氨基酸毒性与细胞的坏死、凋亡密切相关。结合本实验中海马区神经细胞坏死、凋亡的过程，我们认为：（1）脑创伤后早期兴奋性氨基酸的过度释放，依其不同浓度及持续时间，同时诱导了神经细胞的坏死和凋亡，以细胞坏死为主要病理表现；（2）脑创伤后期，随兴奋性氨基酸浓度的下降，神经细胞的延迟性死亡则以凋亡为主，但仍同时伴有细胞坏死的形态学病理改变，这可能与脑创伤后的继发因素，如：细胞内钙离子超载有关。Fineman等[11]报道，细胞内钙离子的浓度于脑创伤后48小时达高峰值，这一结果也从侧面肯定了我们的推测。
脑创伤后神经细胞主要存在三种死亡形式：物理损伤性死亡、兴奋性毒性死亡及延迟性细胞死亡。其中，延迟性细胞死亡是导致长期脑功能障碍的主要因素。本实验结果显示，颅脑创伤后，大鼠海马CA2-3区存在有神经细胞凋亡现象，持续时间至伤后14天：同时，我们于伤后7-10天利用世界上先进的水迷宫技术对大鼠学习记忆能力进行了测试，发现伤后9及10天出现明显的空间学习记忆障碍。据此，我们认为：脑创伤后作为学习记忆功能结构的海马区域存在着神经细胞延迟性丢失，影响了细胞间的信息单向传递及整合，导致了大鼠长期的学习记忆障碍。
二、海马区神经细胞p53蛋白表达与凋亡
P53基因是一种重要的抑癌基因，正常的p53基因即野生型p53基因（wt-p53）与突变型p53基因（m-p53），均参与细胞凋亡的调节，野生型p53对凋亡有促进作用，而突变型p53对凋亡有抑制作用。脑损伤可导致野生型p53蛋白的表达增加[12]，而突变型p53蛋白迄今为止，只在肿瘤细胞中发现[13]。由于我们检测到的p53蛋白主要位于损伤后出现细胞凋亡的位置，因此推测本实验检测到的p53蛋白为野生型p53蛋白。
目前，分子生物学研究结果已初步了解p53介导细胞凋亡的过程 [14]。推测p53介导受损神经细胞凋亡的几个环节如下：⑴首先某种损伤因素（很可能是DNA的轻微损伤）诱导p53在转录和翻译水平大量表达。⑵核内p53 蛋白大量堆积，并与损伤DNA（通常为单链）结合，使p53由静止状态激活，发挥转录因子作用，调节相关基因表达，如：p21WAF表达产物可使细胞周期静止于G1点，并影响细胞周期蛋白活性，使细胞生长和增殖受到抑制[15]，但这一点可能对神经元作用不大。⑶p53 蛋白表达后选择性地抑制c-myc基因的转录，使c-myc mRNA迅速下降，从而诱导细胞凋亡。⑷p53还可以增加bax、IGF、Fas等表达，而间接降低抑凋亡蛋白bcl-2的表达。⑸p53也可能直接下调bcl-2的表达，从而增加神经元凋亡的易感性[16]。⑹p53 蛋白还可以通过与细胞内其它蛋白形成复合物，如复制蛋白抗原（RPA）、转录因子复合物IIH（TFIIH）、修复因子（GADD-45）等，以参与DNA合成、复制、修复及损伤 [17]。
Kaya等[12]利用CCI模型研究了wt-p53蛋白，p53反应蛋白及细胞循环蛋白（Cyclin D1）的表达，认为DNA的损伤诱导了wt-p53蛋白，该蛋白激活了一系列下位效应基因，这些效应基因产物参与了细胞循环停止、DNA修复及凋亡。Napieralski等[19]用原位杂交组织化学技术研究了大鼠一侧液压脑损伤后肿瘤抑制基因p53、细胞循环基因cyclin D1的mRNA表达的区域分布及时程。在假手术组的脑组织没有或仅有极少量的p53mRNA的表达。在伤后6小时，p53mRNA主要被诱导于TBI易损区的细胞，如挫伤的皮质、丘脑的膝状核的中部和侧部的细胞以及海马CA3区及门部的神经元。p53mRNA的增长也在海马CA1区的神经元，即那些对液压脑损伤相对耐受的细胞中检测到。认为p53参与了TBI后的分子反应。在本实验中，我们对重型闭合性颅脑创伤伤后大鼠海马区神经细胞p53蛋白的表达及凋亡情况进行了观察。结果发现，伤后3小时海马CA2-3区锥体细胞层即可检测到p53蛋白的**反应，于12小时**反应明显增强，此时p53蛋白主要定位于胞浆，于伤后1-2天p53蛋白表达达高峰，此时于胞核中亦出现明显的P53蛋白的**反应，伤后3天开始下降。P53蛋白先于凋亡的高峰出现，且与神经细胞凋亡的分布大致相符。以上结果表明，颅脑创伤能够诱导p53蛋白表达，p53蛋白可能参与了调控伤后神经细胞延迟性死亡的病生理过程。
三、海马区神经细胞Bax蛋白表达与凋亡
Bax是Bcl-2家族中*具有促死亡特征的基因。Bax被表达并转位于线粒体是对各种细胞死亡信号的反应[20]。促凋亡的Bcl-2家族成员能够导致细胞色素C从线粒体中释放到胞浆[21]，接着细胞色素C和apaf-1，即CED-4的等同物以及dATP相互作用[22]，这个被激活的复合物可以产生具有活性的caspase-9，caspase-9可以断裂其他的caspase（包括pro-caspase-3），使之具有活性[23]，caspase-3和其它的caspases协调一致，通过对各种蛋白进行分解从而促使细胞死亡[24]。
本研究显示：大鼠伤后6小时海马CA2-3区Bax蛋白的**反应增强，**反应主要定位于胞浆，胞核也可见到，呈弥漫或散在的棕黄色颗粒。于2-3天达高峰，伤后7天明显下降，于14天恢复至正常水平。这和国内的有些学者在液压脑损伤模型中的研究基本相似[25]，只是时程较长，这可能与致伤方法和致伤程度不同。
O'Dell等[26]研究发现，大脑皮质创伤性脑损伤后24小时bax mRNA表达增加。Lu等[27]在对大鼠闭合性脑损伤后**神经系统神经元凋亡的时程进行研究时发现，在伤后4小时Bax蛋白表达增高，并伴随着Bcl-2表达下调，在伤后1天处死的大鼠发现不同数量的TUNEL阳性神经细胞。认为Bcl-2和Bax的比例改变参与了闭合性脑损伤后**神经系统神经元的凋亡。有人研究发现液压脑损伤后早期Bcl-2和Bcl-x蛋白水平下降，损伤的后期Bax蛋白水平升高[25]。结合本实验的结果，我们认为：（1）颅脑创伤诱导了Bax蛋白表达增加，改变了线粒体膜的通透性，导致细胞色素C的释放，激活了caspases，促使细胞死亡。（2）Bax蛋白增加改变了与能够抑制凋亡的Bcl-2及Bcl-x的比例，抑制了Bcl-2及Bcl-x蛋白对细胞的保护作用，间接的促进了细胞的死亡。
四、海马区神经细胞Fas蛋白表达与凋亡
Fas蛋白属于神经生长因子受体（NGFR）/肿瘤坏死因子受体（TNFR）超家族成员，这一家族成员对细胞生存、分化及**反应调节发挥着广泛的作用[28]。Fas蛋白在功能上与TNF-RI密切相关，因为两者都拥有一个能够传递细胞毒性/凋亡信号的死亡结构域[28]。FasL与Fas结合可促发一系列细胞内事件，*终导致靶细胞的caspases激活，细胞死亡[29]。此外，FasL和Fas结合可导致死亡结构域与细胞浆适配蛋白FADD发生联系，这接下来恢复了caspase-8的活性，促发一连串的凋亡事件。现已经在多种细胞类型中检测到Fas抗原，包括B、T**细胞系、肠、胸腺、肝、卵巢及心脏，fas-fasL系统在保持**特权中发挥重要作用[30]。FasL在眼和睾丸中持续表达，有人报道在人、小鼠及大鼠的星形细胞中也有表达[31]。
本实验中，大鼠闭合性颅脑损伤伤后6小时海马CA2-3区出现Fas蛋白的表达增加，于12小时明显增强，2-3天达高峰，7天明显下降，于14天Fas蛋白**反应消失。我们发现Fas蛋白的**反应不但定位于胞浆，而且在核区出现更加强烈的染色，脑损伤后Fas蛋白在胞核中强烈表达尚未见文献报道，其作用机制还有待于进一步研究。
有关脑损伤后Fas蛋白的表达情况国内外鲜有人报道。Rosenbaum等[32]证实，大鼠局灶性脑缺血后缺血区的神经元fas及fasl表达增加，说明fas介导的凋亡参与了脑缺血的病理生理学过程。Beer等[33]在研究大鼠实验性TBI后Fas及Fasl的表达时程中发现，在创伤后15分钟至72小时损伤部位同侧皮质内分别见到增强的Fas及Fasl的**反应。结合本研究结果，Fas蛋白的**反应高峰先于凋亡的高峰出现，我们认为：Fas及Fasl参与了大鼠闭合性颅脑损伤后凋亡性神经变性的病理学机制。
五、美洛宁对脑损伤后学习记忆障碍的影响
美洛宁（三磷酸胞苷二钠）为一种促神经细胞修复和再生的**，具有保护细胞膜结构和血脑屏障，以及减轻毒性代谢物质对神经细胞的损害作用。本实验中，美洛宁**组于伤后9天（P﹤0.01）及第10天（P﹤0.01），Morris水迷宫测试潜伏期明显低于创伤组，两组比较有统计学意义，而于正常组相比无明显差异。运动轨迹图象分析显示，正常对照组、假手术组及美洛宁**组大鼠伤后随时间在搜索策略的改变上也较创伤组更为理想。同时，我们在研究中发现，美洛宁能够明显抑制海马区细胞凋亡基因p53、Bax和Fas蛋白的表达，并且使该区凋亡细胞的高峰下调。
三磷酸胞苷（CTP）作为参与磷脂、蛋白质及核酸代谢的有效成分，能够**营养神经细胞。国外有实验研究已证实了CTP能减轻甚至逆转多种原因所引起的神经系统损伤，如：中毒性、代谢性、创伤性及缺血性脑损伤等[34]。重型颅脑损伤可导致不同程度的颅内压增高、脑灌注压降低、脑缺血、缺氧等。实验证实，CTP**外伤引起的意识障碍等神经功能紊乱，主要是通过其神经营养作用来降低脑水肿。磷脂酰乙醇胺（脑磷脂）和磷脂酰胆碱（卵磷脂）是细胞膜的主要成分，CTP直接参与甘油磷脂与核酸的合成。研究表明，细胞内磷酸乙醇胺胞苷酰基转移酶（PECT）、磷酸胆碱胞苷酰基转移酶（PCCT）的活性和磷酸酯合成率对CTP细胞浓度具有高度的依赖性。PECT对CTP的依赖性更大[35]。CTP通过多种途径参与脑磷脂合成，在提高神经细胞膜的合成率方面发挥重要作用[36]。
综上所述，我们认为美洛宁能够有效的改善大鼠脑创伤后空间学习记忆障碍，其机制可能为：1、为伤后神经细胞提供能量，减少由于缺血、缺氧而产生的毒性代谢产物对神经细胞的损害；2、抑制了伤后凋亡相关基因，如p53、Bax及Fas蛋白的表达，减少伤后神经细胞的延迟性死亡；3、为伤后神经细胞提供营养，参与甘油磷脂及核酸的合成，保护细胞膜结构，促进神经细胞的修复和再生，重建海马信息环路。
总之，颅脑创伤后存在学习记忆功能障碍，伤后神经细胞凋亡是多种因素改变相互作用的结果。本研究中，我们讨论了脑创伤后p53、Bax及Fas蛋白的表达、神经细胞凋亡与学习记忆功能障碍之间的联系，以及美洛宁对其的影响，而它们与其它因素之间的内在联系，尚需我们在分子生物学水平进一步探讨，这将为临床**颅脑损伤，特别是基因**的开展提供新的思路。
结 论
本研究应用Marmarou闭合性颅脑创伤模型，采用HE染色、**组织化学、原位细胞凋亡检测及Morris水迷宫技术对伤后大鼠海马区p53蛋白、Bax蛋白和Fas蛋白的表达、神经细胞坏死、凋亡以及与大鼠伤后空间学习记忆功能的关系进行了研究，探讨了美洛宁对大鼠伤后学习记忆功能障碍的**作用，结论如下：
1 重型闭合性颅脑损伤后海马区神经元存在延迟性细胞死亡现象，其形式不仅表现为坏死，也表现有细胞的凋亡。
海马区神经细胞延迟性死亡是造成伤后长期学习记忆功能障碍的主要因素之一。
凋亡相关蛋白p53、Fas及Bax的表达改变可能参与调控了细胞凋亡的过程。
美洛宁可能通过抑制p53蛋白、Fas蛋白及Bax蛋白的表达，从而抑制神经细胞凋亡。
美洛宁可能通过抑制神经细胞坏死凋亡、促进细胞修复及重塑信息环路对伤后学习记忆功能障碍发挥**作用。
大鼠脑创伤后对学习记忆功能影响的实验研究
