运动影响学习与记忆能力动物实验的研究进展
摘 要： 生理心理学的主要研究途径和方法是通过建立相关动物模型，施加一定的影响因素，运用特殊的测量方法和指标，对实验动物的整体水平或局部器官和组织进行研究。动物实验可以克服人体实验诸多的局限，达到理想的效果。伴随着运动生物科学的不断发展，运动与学习记忆动物模型的制作、反映指标的测定会不断的改进，将在阿尔茨海默病及脑健康相关问题的防治过程中发挥重要的作用。
关键词： 学习记忆；动物模型；运动方式；迷宫
阿尔茨海默病（又称老年痴呆），是一种以进行性认知功能障碍和记忆损害为特征的**。随着社会人口的老龄化，阿尔茨海默病的发病率逐年上升，已成为世界范围的、越来越引起人们重视的健康问题。它不仅影响患者的生存质量，而且给家庭和社会带来了沉重的负担。据相关文献显示，适宜的运动可以对老年痴呆或缺血性脑梗死患者在改善认知、记忆、行为能力方面获得明显的疗效。关于运动与学习记忆的研究，过去由于受实验方法和检测手段的限制，只是在脑神经生化标志物及其他行为等无创性指标方面较多。20 世纪后期，随着动物实验的开展以及脑分子生物学、生物化学、多种迷宫方法的应用，运动与学习记忆的研究进入了一个崭新的阶段。
1 运动影响学习与记忆研究中的动物模型
建立理想的学习记忆实验动物模型，是开展运动与学习记忆研究工作的基础。动物模型的制备应尽量模拟临床致病因素，以期在发病机理、运动干预等方面获得科学的数据。
1.1 老年痴呆（AD）模型
理想的AD动物模型应具有与老年性痴呆相似的基本特征：一、模型动物具有AD的主要神经病理学特征老年斑（SP）和神经元纤维缠结（NFT）；二、出现AD的重要病理变化如大脑神经元死亡、突触丢失和反应性胶质细胞增生等；三、行为学上出现认知和记忆功能障碍。
AD动物模型的研究经过几十年的努力取得了很大进展,目前大致可概括为：一、自然衰老模型：SAMPs鼠由日本京都大学竹田俊男教授开发成功，主要以学习记忆功能增龄性加速衰退，**神经系统如皮质、海马等部位发生病理改变为主，是一种比较理想的研究脑老化和痴呆的模型。二、损害模型：Nelson等将D—半乳糖注入大鼠侧脑室，6周后**组化分析可见NFT样磷酸化和Aβ淀粉样沉积斑块，引起记忆严重缺失。H等利用小鼠脑室内注射AlCl3、长期腹腔内连续注射或口服铝溶液获得NFT病理改变的动物模型等等。三、转基因动物模型：通过转基因技术将AD的APP变异基因植入鼠，其脑能产生β淀粉样蛋白沉积、神经炎性老年斑、突触减少、星形细胞和小胶质增生、神经元退化及神经元程序性坏死等AD症状。
但每一种模型都只是在一定程度或某些方面模拟了AD的症状和病理改变，它们各有优势和不足，应根据不同的实验目的选择合适的模型。总体趋势从单因素的损伤模型到复合损伤模型，从单转基因模型到双转甚至三转基因模型，但仍存在诸多问题，如造价昂贵等，目前国内多数实验室都选择代价较少的复合损伤AD动物模型。随着对AD发病的细胞分子机制认识的不断深入,新的更完善的动物模型将会出现， 进一步促进对AD发病机制的了解和推动防治研究的进步。运动影响学习与记忆能力动物实验的研究进展
1.2 血管型痴呆（VD)模型
VD*主要的致病因素是脑血管缺血，其动物模型的制作有血管阻断法、栓塞法、大脑中动脉梗死法、光化学法、去大脑皮层法、脑血管定位阻断法以及自发VD模型等，如：国内常通过光化学法诱导的双侧海马梗死模型观察大鼠双侧海马梗死后训练对学习记忆功能的影响。国外是参照小泉线栓法制成右侧大脑动脉缺血梗死模型大鼠，表现为提尾时左侧前肢内收屈曲，同侧Horner氏征，爬行时向左划圈，站立时左侧倾倒。VD是一种多因素**，其发**展是多种致病因素、多个病理环节相互作用和累积的结果。而目前VD动物模型的制备都是从模拟人类VD发病的某一侧面来完成的，与临床实际还有一定的偏差。
1.3 基因（GD）模型
Shimizu等利用第3代基因敲除技术培育成海马CA1区特定的NR1基因敲除小鼠来研究NMDAR在记忆巩固阶段的作用,NR1基因敲除后, CA1区NMDAR兴奋性突触后电位消失,无LTP的产生,并且在隐藏平台水迷宫试验中逃跑潜伏期明显延长,说明海马CA1区空间学习记忆需要NMDAR的参与[5]。Tang等利用转基因技术,使NR2B 在转基因小鼠的前脑过度表达,发现NMDAR通道开放时间延长,活性增强,这些转基因小鼠在多种行为测试中表现出更好的学习和记忆能力[6]。
2 运动与学习记忆研究中动物的运动方式
2.1 游泳训练
游泳是运动与学习记忆实验中运动负荷的主要手段之一，通常把大鼠或小鼠作为游泳运动的研究对象，多采用静水泳池。运动强度需要综合考虑水温、负重、时间等影响因素。
2.2 跑台/跑轮运动
段氏动物跑台主要是根据大鼠或小鼠跑步运动而设计的实验装置，目前应用较多，运动强度可通过调整跑的时间、跑速和跑台坡度来准确控制，属于被动运动。而跑轮是指动物在笼子中自主进行蹬爬，为主动运动。
2.3 滚筒式网状训练
滚筒式网状训练器为长100cm,直径60cm的圆形网状仪器,中间分为4个格,可同时训练4只鼠,底座有一固定架,一端有一手摇柄,可手摇按5r/min进行转动训练，该器材可训练大鼠的抓握、旋转、行走等功能。
2.4 平衡木训练
平衡木训练采用长170cm,宽2cm的方木棒,平放在距地面7 cm处,作为一个平衡木让鼠在其上行走,主要评估及训练平衡功能。
2.5 网屏训练
网屏为50cm ×40cm网带,网眼为1cm ×1cm,网板的左右和上方都用25cm高的木板边框,网屏距地面高度为80cm,先将网屏水平放置,将老鼠放在其上,然后缓缓地将其一端抬高,在2 s内将此屏变成垂直位,保持5s,观察大白鼠是否会从网屏上掉下来或用前爪握住网屏,从而客观地评价前爪抓握能力及肌力情况。
2.6转棒训练
转棒疲劳仪训练取长150 cm,直径415cm的木棒一根,其中点固定在3r/min的转动器上,分别向左右交替转动，可评估及训练动态的平衡功能。
3 运动影响学与记忆研究中行为学指标测定方法
3.1 迷宫
迷宫在实验动物心理学形成及发展中的作用至关重要，从19世纪末20世纪初开始，迷宫已经成为心理学家测试动物能力常用的仪器。迷宫任务对实验室测试特别适用，因为仪器本身可以告知动物需要它们做的是什么（类似于人类实验的指示语）[7]。目前在学习记忆研究中*常用的有Morris水迷宫、Y迷宫、T迷宫以及4臂以上的放射臂迷宫等，涉及的被试动物主要是鼠。在迷宫实验中通常采用的指标为：被试达到某一指定标准前所需要的学习次数；每轮实验的错误次数和产生的位置；每轮实验所需时间以及实验中的行为表现。国内研究中应用*多的迷宫方法是Morris水迷宫和Y迷宫，作为考察辨别学习的工具，检验动物学习记忆特点及其脑机制以及运动对动物学习与记忆能力的影响等。
Morris 水迷宫是英国心理学家Morris于20世纪80年代初设计和使用的进行大鼠空间学习记忆研究的装置，是较理想的测定动物空间学习记忆能力的行为实验模型。Morris水迷宫为一圆形水池,直径200cm,高50cm,水深30cm,水温控制在22～24℃。池壁标明4个入水点,由此将水池分为4个象限,任选其中一个象限,正中放置一个直径11cm、高29cm的平台。包括：一、定位航行实验：每天将实验大鼠按东、南、西、北4个入水点依次放入水池中,同时记录其在120s内寻找平台的时间。二、空间探索实验：将平台撤走,进行大鼠120s内穿越原平台位置的次数。运动影响学习与记忆能力动物实验的研究进展
XR-XM101型morris水迷宫
Y迷宫为一个三等臂式迷宫，每臂顶端设一信号灯,信号灯亮后6s ,此臂即为危险区,通以36V 交流电,刺激大鼠从所在的亮臂跑到暗臂。训练中始终有一臂为**区,**区按无规则的次序变换。如果大鼠在通电后从所在亮臂跑到另一亮臂记为错误,跑到暗臂则为正确。连续10 次测试中有9 次正确即为掌握迷宫结构,训练次数越少表明大鼠学习能力越强，以此作为判断大鼠学习分辨能力的指标 。
3.2 多功能反应箱
实验方法:将多功能条件反应箱平放在60cm高的桌边,跳板完全悬空,将小鼠尾对门洞平放在跳板上,小鼠能很快找到门洞并进入反应箱,这段时间记为电击前步入潜伏期，关闭门洞,并用适宜电压电击前爪5～10s。如此反复3 次,24 h后重复测定小鼠在跳板上停留的潜伏期,记为电击后步入潜伏期,*长观察时间为300 s。凡达到300 s 仍不进入反应箱者,均视为记忆保持良好。
3.3 开场行为观察
开场行为观察也称为旷场实验，运动前、后将小鼠放入开场环境中，记录小鼠1min内跑动的格数，3min内跑动的格数、后腿站立（包括扶壁站立和自由站立）次数、理毛次数、小便次数、大便粒数，用来观察小鼠运动前后的反应。
4 运动影响学习与记忆研究中的评价指标
在脑功能定位分区中,海马是研究动物和人类学习记忆、情绪、行为功能的经典脑区，而海马神经的突触可塑性则直接影响学习记忆功能。在脑科学的研究中，长时程增强 (LTP)效应被认为是神经突触可塑性和突触传递的一种表现形式 ，是学习记忆的神经细胞学基础。因此凡是能影响海马和LTP的指标均可以反映学习记忆能力。运动影响学习与记忆能力动物实验的研究进展
4.1 与LTP间接相关的物质
4.1.1 细胞凋亡
学习与记忆是大脑主要的**神经功能之一,是由不同而又紧密联系的神经元共同作用的结果。因此,保持神经元的健康和脑细胞的可塑性是学习和记忆的先决条件。已有研究报道,大鼠认知功能受损可能与海马神经元的凋亡有关,脑细胞过早凋亡可引发脑萎缩、老年痴呆、帕金森氏症等脑病,从而影响学习、记忆能力。Bcl-2、Bax是有关细胞凋亡的重要调控基因,Bcl-2又称为“生存基因”,表达水平与细胞寿命呈正相关。而Bax为促凋亡基因,可使细胞器释放出某些分子,引起半胱氨酸蛋白酶的活化,并拮抗Bcl-2的保护效应而使细胞趋于凋亡,或者通过启动线粒体通透性转变的方式诱导细胞凋亡。**（2008）实验表明长期有规律的游泳运动可促使大鼠Bcl-2的表达增多, Bax的表达减少,抑制海马细胞发生过早凋亡现象。
4.1.2 抗氧化物质
自由基具有强氧化性，可在体内氧化损伤许多器官和组织，进而引起慢性**及衰老效应。还可与细胞膜双层结构中的不饱和脂肪酸反应产生过氧化脂质，后者经过分解生成丙二醛，丙二醛易与蛋白质或脂类聚合交联作用形成脂褐素，因其不易被溶酶体消化,随增龄而积累,所以被认为是细胞衰老的基本特征。大脑中脂褐素主要积聚在大脑皮层和海马部位，学习记忆能力与大脑中脂褐素的含量呈负相关。金花等(1995)报道运动训练使大鼠大脑皮层的脂褐素下降，其机制可能是适量的训练通过降低脂质过氧化水平,减弱丙二醛交联作用,从而减少脂褐素的生成,减慢在细胞中的积累,延缓老化过程。机体内抗氧化系统对减轻自由基增加而引起组织损伤也有重要作用，其中一种重要的抗氧化酶是超氧化物歧化酶（SOD）,它能催化生物氧化产生的O2- 转化为H2O2 和O2+ ,以防止对细胞的损伤，Jenkins(1993年)报道有氧运动可提高SOD 活性。抗氧化系统中还有一种重要的抗氧化剂,还原型谷胱甘肽(GSH)，Kretzchmar(1990 年)报道训练有素的长跑运动员血浆中GSH 浓度较一般人。这些均说明适度运动可增加脑组织抗氧化及抗衰老能力。
4.1.3 突触可塑性
突触可塑性包括突触传递可塑性、发育可塑性和形态的可塑性。大脑皮层和海马是学习记忆功能相关脑区，衰老时该区域突触形态结构和数量发生变化，包括突触密度减少、突触界面曲率降低、间隙宽度加大、突触后致密物质变薄、突触膜的流动性降低以及突触素含量减少等，均与学习记忆功能障碍密切相关 。突触可塑性的变化还可能是阿尔茨海默病神经生物学基础。任珊珊等（2010年）实验研究表明9周的跑台运动可逆转衰老小鼠突触数量衰减和突触膜流动性下降，说明适量运动可以促进衰老化过程中大脑认知功能区突触的可塑性代偿，延缓老年痴呆的发生。运动影响学习与记忆能力动物实验的研究进展
4.1.4 脑内神经递质
卡尔森于1958年首先报道了脑内多巴胺（DA）的存在，并阐明了DA的信号传递功能以及它在人类控制运动中的作用；格林加德发现了多巴胺和其它相似递质刺激神经细胞时的过程；坎德尔在格林加德理论的基础上，通过海兔的缩鳃反射实验证实，记忆功能就是由无数构成神经细胞间接触点的突触直接改变引起的，神经递质DA通过**信使引起蛋白磷酸化，后者进入细胞核，启动新蛋白质合成，从而使生物产生了短期和长期记忆，由此可见DA与学习记忆功能有密切的关系。徐波等（2004）实验表明长期适宜的游泳训练能增强大鼠脑内海马、伏隔核和前额叶皮层中的DA，然后通过神经递质的正相调控作用可提高大鼠的学习记忆能力。
4.2 与LTP直接相关的物质
4.2.1脑源性神经营养因子
BDNF是由德国神经生物学家Barde于1982年首先报道的，它主要在脑组织合成，广泛分布于**神经系统，其中大脑皮质、海马等部位含量较为丰富，不但对神经系统有营养作用，还与突触功能和可塑性的调控有关。BDNF作用的主要受体是TrkB（trosine kinase B），通过配体受体结合，诱导神经元胞体上的Trk酪氨酸激酶形成二聚体和自磷酸化，从而激活胞内信号转导通路发挥其功能作用。Jovanovic等报道BDNF能易化与学习记忆过程联系密切的神经递质谷氨酸的释放，这是通过BDNF/TrkB/MAPK信号级联反应对突触蛋白的磷酸化水平进行调控而实现的。Xiong等报道BDNF可调节**神经系统NO的合成，有助于NO所介导的学习记忆过程。Lin的研究显示BDNF能磷酸化海马CA1区突触后NMDA受体的NR1和NR2，产生LTP，提高学习与记忆功能。Neeper等的实验发现一周的自愿转轮运动即可显著增加大鼠海马和新皮层BDNFmRNA的水平，进而通过介导细胞内多种信号转导通路对学习记忆起促进作用。
4.2.2 胰岛素样生长因子—1
lGF—1是Sallmon和Daugha—day于1957年首先报道的。IGF-1及其受体广泛存在于脑中，特别是海马组织，能促进神经细胞生长、分化和增值，减少局部缺氧缺血造成的脑神经元损伤，刺激胶质细胞分化，刺激DNA合成和轴突生长，调节海马乙酰胆碱的释放，调节海马突触的可塑性，并有抗凋亡作用。另外，IGF-1与年龄相关的神经退行性**的发病机制有关，如阿尔茨海默病。在运动诱导下，海马内IGF-1水平升高，海马内的IGF—l和BDNF通过其受体激活p-CAMKlI和p-MAPK II信号级联，进而增加突触素一1，突触素一1又可以促进Glu释放，增强突触间的信息传递，使长时程记忆增强，故运动促进IGF-1的表达可能是运动促进学习记忆的机制之一。
4.2.3 MAPK/ERK
MAPK/ERK信号转导通路是多种细胞外信号从细胞表面传导到细胞内的重要传递者，丝裂素活化蛋白激酶（MAPK）是细胞内的一类丝氨/苏氨酸蛋白激酶，细胞外信号调节激酶（EPK），是MAPK家族中的重要成员。ERK被激活后发生核转位可直接激活转录因子Elk—1，启动即早基因的转录；ERK也可通过激活核糖体S6激酶（Rsk）来激活转录因子cAMP效应元件结合蛋白(CREB), 长期记忆的形成需要启动基因的表达。同时在海马CA1区活化的ERK可使组蛋白H3的乙酰化增加，组蛋白是染色质的主要组成成分，而DNA被紧密地包裹在染色质中，从而有助于基因的表达。Shen报道适宜的运动，使 MAPK / ERK信号通路磷酸化水平提高，通过诱导BDNF和其他神经营养因子等靶基因的表达，提高学习记忆功能。
4.2.4 CREB
80年代后期，Montrminy MRL和Yamamoto KK在研究基因转录的调节时，先后通过亲和层析的方法，从PEI2细胞系的核抽提物和大鼠脑组织中，分离纯化得到环磷酸腺苷反应元件结合蛋白（CREB），其作为一种核转录因子，在学习记忆中有着重要作用，长期记忆的形成不但需要新蛋白质合成，而且也需要新基因的转录，来自对海兔、果蝇、小鼠以及大鼠的大量研究表明，磷酸化后的CREB是海马区基因转录的开关，它引发的基因表达可加强海马区长时程记忆的形成。AndersonBJ研究表明经过对大鼠7周的主动训练，可以引起**神经系统内cAMP、Ca2+等**信使增加，使CREB参与记忆的形成。从细胞信号转导的角度来看，不同通路在*后共同作用于CREB，通过影响CREB的磷酸化来激活c—fos、BDNF等多种与记忆有关的靶基因转录，*终导致学习记忆能力的提高。
4.2.5 GLU/NMDA
谷氨酸是**神经系统*主要的兴奋性递质，通过激活谷氨酸受体介导快速的兴奋性突触传递，与学习记忆过程有密切关系。其中谷氨酸离子型受体NMDA(N—甲基—D—天门冬氨酸)是非常重要的突触后成分，不仅可诱导出兴奋依赖性的突触可塑性，而且在细胞间的信息传导中也发挥着重要作用。LTP的形成和维持都需要NMDA受体的参与，因此NMDA受体被认为是突触可塑性及皮质和海马神经元长时程增强效应的主要调控者，构成了**神经系统的重要功能和学习记忆的分子基础，其主要由NR1和NR2两种亚基构成。张辉等（2007）报道适宜的运动训练，如滚筒式网状训练、平衡木训练等，可以促进NR1和NR2表达，进而NMDA密度增加，LTP产生增多，突触的传递效率提高，有利于学习记忆能力的增强。运动影响学习与记忆能力动物实验的研究进展
4.2.6 NO/NOS
海马NO主要来源于神经元的NOS（一氧化氮合酶），现已明确NO作为逆行递质参与LTP的形成，其机制是：突触后NMDA受体及非NMDA受体激活，Ca2+内流，与钙调蛋白一起活化NOS，催化产生NO；NO可自由而迅速地透过细胞膜，进入突触前成份，激活可溶型鸟苷酸环化酶(sGc)，并使sGC活化后引起细胞内cGMP水平升高，进一步促进谷氨酸合成及递质释放；谷氨酸再作用于突触后NMDA及非NMDA受体而实现对LTP的诱导。孙国欣等（2006）报道中等强度运动可以使大鼠海马CA1区NOS及其亚型表达升高，NO生成量增多，从而改善了学习记忆能力。而刘鸿宇等（2006）报道大强度训练刺激海马N0/N 0S过度表达，过量的NO在**神经系统中又有毒性作用,影响学习记忆。
4.2.7 C-FOS
c—fos和c—jun属于即早刻基因家族，与学习记忆有关。当其被快速诱导转录时，胞浆中的mRNA数量迅速增加，翻译出的Fos和Jun进入细胞核内并形成异源二聚体Fos—Jun复合物，该复合物结合到靶基因的调节区,成为TPA反应元件(TRE)的7bp增强子单元，从而进一步影响靶基因的表达。已发现许多与记忆密切相关的基因，如胶原酶、神经生长因子和珠蛋白启动子中都有TRE区，Fos—Jun复合物即可结合到这些基因的TRE区，诱导其表达，因而，c—fos基因通过影响转录和翻译控制进而影响学习记忆功能。杨毅飞等（2005）报道长期适宜的运动训练可以引起**神经系统内cAMP、ca2+等**信使适量增加，从而诱导c—fos基因表达，控制下游靶基因的转录，从而合成新的蛋白质，因此，有利于大脑的记忆功能，这将为运动促进学习记忆在分子水平上提供一个有力的证据。
4.2.8 CaM/CaMK
长时程增强LTP是以突触后致密结构(PSD)为基础的，Ca2+／CaM依赖性蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)是一种钙依赖性蛋白激酶，约占PSD蛋白总量的30％一50％，在突触部位起记忆的分子开关作用。CaMKⅡ自身磷酸化后变成不依赖Ca2+的活化状态，活化的CaMKⅡ对学习记忆有以下作用：
（1）活化的CaMKⅡ移向谷氨酸受体，对受体进行磷酸化，从而进一步活化谷氨酸受体。
（2）活化的CaMKⅡ磷酸化离子通道，从而改变神经元的兴奋性。
（3）活化的CaMKⅡ磷酸化中间纤维，改变了神经元的形态、突触的数量及结构。孙臣友等报道游泳训练使位于NMDA受体通道内阻止ca2+内流的Mg2+移开，这样通道打开，ca2+内流，继而激活ca2+／CaM**信使，Ca2+／CaM激活CaMKⅡ的基因表达，从而通过CaMKⅡ的自身磷酸化使谷氨酸受体的亚基磷酸化增加，保证了突触信号传递的有效进行，使学习记忆能力得到提高。
以上指标从不同角度反映运动引起模型动物学习记忆的变化以及程度，但这些指标均有局限性，需要综合多种信息才能准确判断。
